李昕蔓,龐丁瑋，2,柳俊明,王立成,李清泉,張軍

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2 河北霧靈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局， 河北 興隆 067300；3 保定市滿城區(qū)苗圃場(chǎng)，河北 滿城 072150)

新疆野蘋果[Malussieversii(Ledeb.) Roem]是與栽培蘋果品種親緣關(guān)系最近的野生種[1-3]。Richards等的研究證明，新疆野蘋果是第三世紀(jì)的1種殘遺植物，是栽培蘋果品種的祖先種，其主要分布在天山山脈西部的托里縣、鞏留縣、霍城縣、新源縣、額敏縣等地區(qū)[4-5]。新疆野蘋果種質(zhì)資源極其豐富，被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種中唯一的天然基因庫(kù)，也是世界野蘋果基因庫(kù)的重要組成部分[6-7]。新疆野蘋果適應(yīng)性和抗性很強(qiáng)，具有抗寒、抗旱、抗病、耐蟲(chóng)、耐瘠薄等優(yōu)良特性，并且變異豐富。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeats，SSR)，是一種由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于植物基因組中[8-15]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，親緣關(guān)系鑒定及遺傳多樣性分析也從表觀遺傳學(xué)水平的研究逐漸深入到分子水平，尤其是最近幾年，SSR分子鑒定技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種植物的品種分類鑒定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和利用、DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測(cè)與分析、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面，極大地推動(dòng)了分子技術(shù)的進(jìn)步[16]。

部分學(xué)者對(duì)新疆野蘋果PCR反應(yīng)體系及SSR親緣關(guān)系鑒定方面進(jìn)行了初步探究，取得了一定的研究進(jìn)展。張?jiān)菩愕妊芯苛诵陆疤O果PCR反應(yīng)體系中各成分的濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，最終得到了新疆野蘋果最佳反應(yīng)體系[7]。Zuo等以18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系為研究對(duì)象，對(duì)葉形性狀和SSR分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，說(shuō)明葉形性狀與部分SSR位點(diǎn)關(guān)聯(lián)比較緊密[17]。李政等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)包括新疆野蘋果無(wú)性系、鮮食蘋果品種、蘋果砧木品種等3類蘋果屬種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及引物的效率值分析，結(jié)果表明，新疆野蘋果的遺傳多樣性高于鮮食蘋果和蘋果砧木品種；鮮食蘋果起源于新疆野蘋果；選擇的引物不同，其遺傳參數(shù)和效率值不同[18]。馬衣努爾姑·吐地等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，用4對(duì)引物構(gòu)建62個(gè)新疆野蘋果品種的指紋圖譜，并對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行了鑒定，將其分為4大類群，又以核型特征與遺傳圖譜結(jié)合，使新疆野蘋果種下類型間的親緣關(guān)系更加清晰明確[19]。秦偉等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)21份新疆當(dāng)?shù)靥O果品種進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，結(jié)果表明，新疆當(dāng)?shù)靥O果品種是由新疆野蘋果馴化而來(lái)的，也可能是雜交育種或者栽培過(guò)程中出現(xiàn)的遺傳變異形成的[20]。

研究以18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系為試驗(yàn)材料，基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定并構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為新疆野蘋果的品種分類鑒定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和利用、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究提供科學(xué)的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系是2010年從新疆天山地區(qū)新源縣、鞏留縣采集的600株新疆野蘋果野生單株中篩選出來(lái)的，選擇樹(shù)形端莊、優(yōu)美，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，無(wú)病蟲(chóng)害的植株，于第2年嫁接在保定市滿城區(qū)苗圃場(chǎng)的2 a生的海棠(Malusspectabilis)砧木上，每個(gè)無(wú)性系嫁接10株，苗木生長(zhǎng)期間正常水肥管理。

每個(gè)無(wú)性系隨機(jī)選取10片生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲(chóng)害、成熟、無(wú)破損的葉片，放到-30 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，用于SSR分子鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

提取DNA采用改良的CTAB法[21]，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，檢測(cè)合格后，將所有DNA稀釋至50 ng/μL，統(tǒng)一放到-30 ℃的冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增采用20 μL的反應(yīng)體系，其中包括：50 ng/μL的DNA模板2 μL，rTaq聚合酶0.2 μL，DNTP0.5 μL，10×buffer2 μL，10 μM的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O14.3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))；變性95 ℃ 30 s，退火50～60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s(35個(gè)循環(huán))；延伸72 ℃ 7 min(1個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物用 8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測(cè)，在270 V電壓下電泳30 min，然后用硝酸銀溶液染色，氫氧化鈉溶液顯色，最后拍照，讀帶。SSR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。 SSR引物的選擇詳見(jiàn)表1。

表1 SSR引物的選擇Table 1 Selection of SSR primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，用軟件Excel統(tǒng)計(jì)SSR電泳分離出的多態(tài)性條帶，并轉(zhuǎn)換成0/1數(shù)據(jù)[22]。

用軟件DPS 7.05用類平均法(UPGMA)繪制18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系的聚類圖。

用軟件PIC Calc 0.6計(jì)算引物多態(tài)性信息量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

13對(duì)SSR引物的多態(tài)性分析見(jiàn)表2。

由表2可知，13對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出62條條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)在3～6條之間，其中引物CH03d12、CH02a04、CH05c04擴(kuò)增條帶(6條)最多，引物CH02d08和CH03g04擴(kuò)增條帶(3條)最少，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶4.77條。每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在3～6個(gè)之間，平均每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為4.77個(gè)，各引物的多態(tài)位點(diǎn)百分比均為100%，各引物的PIC值在0.512～0.879之間，其中引物CH02a04的PIC值最高(0.879)，引物CH03g04的PIC值最低(0.512)。根據(jù)Botstein的理論，當(dāng)PIC<0.25時(shí)，引物多態(tài)性較低，當(dāng)0.250.5時(shí)多態(tài)性較高。按照此參數(shù)，本試驗(yàn)所用引物具有較高的多態(tài)性，能夠較好的區(qū)分18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系。

表2 SSR引物的多態(tài)性分析Table 2 Polymorphism analysis of SSR primers

2.2 18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系DNA指紋圖譜構(gòu)建

18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系DNA指紋二維碼見(jiàn)圖1。

圖1 18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系DNA指紋二維碼Figure 1 DNA fingerprint two-dimensional code of 18 Xinjiang wild apple clones

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，DNA指紋圖譜數(shù)量越來(lái)越龐大，DNA指紋圖譜的構(gòu)建有利于植物信息的長(zhǎng)期保存，能夠快捷、高效、大量的記錄植物信息，并且其解碼方便、易修改，便于工作者快速查詢相關(guān)資料，為后續(xù)的科研工作提供科學(xué)的理論依據(jù)和參考，因此，進(jìn)一步完善植物DNA指紋圖譜顯得尤為重要。

研究基于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，利用草料二維碼轉(zhuǎn)換器構(gòu)建了13對(duì)SSR引物擴(kuò)增的18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系的DNA指紋二維碼(圖1)，二維碼內(nèi)容包括圖譜代碼、引物名稱及編號(hào)、引物序列、擴(kuò)增片段數(shù)、擴(kuò)增條帶大小以及各無(wú)性系的基本特性。圖譜代碼由引物名稱字母編碼以及擴(kuò)增出的片段大小數(shù)字編碼組成。引物CH03g12、CH03g07、CH03d12、CH02a04、CH05f06，CH02a08、CH02d 08、CH01F02、CH05c04、CH01h01、CH04e0、CH04 f10、CH03g04分別編號(hào)為A～M，分別記錄每個(gè)無(wú)性系經(jīng)過(guò)以上13對(duì)引物擴(kuò)增后的片段大小即bp值，以此生成每個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系的SSR圖譜代碼。例如：無(wú)性系M-1的SSR圖譜代碼是A200B 200C140/162D160E130F130G125H125I125J120K 170/190L110/120M180，該指紋代碼表示的是無(wú)性系M-1在不同引物擴(kuò)增下，擴(kuò)增片段的bp值。

2.3 18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系SSR聚類分析

18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系SSR聚類分析見(jiàn)圖2。

圖2 18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系SSR聚類分析Figure 2 SSR cluster analysis of 18 Xinjiang wild apple clones

由圖2可知，18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系可以被100%區(qū)分開(kāi)，遺傳距離的變化范圍為0.182～0.598，平均遺傳距離為0.459。在遺傳距離為0.566處，18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系被分為4類。第一類為M-1、M-14、M-13、M-16、M-3、M-4、M-6等7個(gè)無(wú)性系；第二類僅有M-15 1個(gè)無(wú)性系；第三類為M-2、M-5、M-9、M-11、M-12等5個(gè)無(wú)性系；第四類為M-7、M-17、M-18、M-8、M-10等5個(gè)無(wú)性系，并未完全按照地理起源分開(kāi)，分析其主要原因可能是這18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系的采集地點(diǎn)相對(duì)較近，不同群體間存在頻繁的基因交流，幾乎不存在天然阻隔。

3 結(jié)論與討論

研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)用蘋果屬的13對(duì)SSR核心引物對(duì)18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定并做了聚類分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建，進(jìn)一步為新疆野蘋果品種分類鑒定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和利用、DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測(cè)與分析、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面的研究提供參考。通過(guò)對(duì)每對(duì)引物分析可知，每對(duì)引物的多態(tài)性信息含量(PIC)各有不同，不同的引物之間存在一定差異。研究用13對(duì)SSR核心引物共擴(kuò)增條帶62條，平均擴(kuò)增條帶4.77條，多態(tài)位點(diǎn)百分比為100%，各引物的PIC值在0.512～0.879之間，引物的多態(tài)性比較豐富，每對(duì)引物能夠檢測(cè)到的信息量是有一定差距的，也充分說(shuō)明了新疆野蘋果的遺傳資源極其豐富，遺傳多樣性較為廣泛，具有較大的選擇潛力，其主要原因是新疆野蘋果在漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化與人工選擇的過(guò)程中，逐漸適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件，遺傳變異較為豐富，遺傳多樣性較高。這與Zuo L H[17]、李政[18]等對(duì)新疆野蘋果遺傳多樣性的研究結(jié)果一致。

研究中13對(duì)SSR引物將18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系分成了4類，聚類結(jié)果并未將其完全按地理起源劃分開(kāi)，其主要原因可能是這18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系的收集地點(diǎn)距離較近，不同群體間沒(méi)有天然阻隔，基因交流相對(duì)頻繁[17]。

雖然有些學(xué)者也對(duì)新疆野蘋果的種質(zhì)資源進(jìn)行過(guò)分子鑒定，但并沒(méi)有構(gòu)建其DNA指紋圖譜，而本研究基于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，利用草料二維碼轉(zhuǎn)換器構(gòu)建了18個(gè)新疆野蘋果無(wú)性系13對(duì)SSR核心引物擴(kuò)增結(jié)果的DNA指紋二維碼活碼，該活碼具有包含的信息量大、解碼方便、快捷、高效、修改比較容易等優(yōu)點(diǎn)，而得到廣泛應(yīng)用。在今后的科研中，我們要利用更多新疆野蘋果種質(zhì)資源及SSR引物構(gòu)建二維碼活碼，提供更為全面準(zhǔn)確的新疆野蘋果DNA指紋圖譜。