溫 穎 吳 健 吳培豐 高穎龍 陳 平 譚家輝 何洪濤 王向陽 張建明（通訊作者）廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510635）

趙 衛(wèi) 謝 茜 趙久波 余健海 覃直然 南方醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院（廣東，廣州，510515）

耐藥結(jié)核始終是結(jié)核病防控的焦點與難點［1］，尤其是耐多藥結(jié)核（MDR-TB），其傳播危害大、傳染期長、治療費用高（是普通肺結(jié)核的100倍）、治愈率低（約為50%），是影響結(jié)核病防控工作的最重要因素。2019年，全球近50萬人患單利福平耐藥結(jié)核（RR-TB），其中78%的人患MDR-TB［2］。若MDR-TB患者在口岸未能及時準確檢出，造成跨境傳播［3-4］而至暴發(fā)［5］，將對我國境內(nèi)以及境外個人、家庭和國家造成嚴重的公共衛(wèi)生負擔(dān)。因此，我國口岸對傳染性肺結(jié)核的診斷不應(yīng)僅局限于臨床病原體的鑒定水平，快速、準確且高通量的MDR-TB檢測技術(shù)，將是未來口岸結(jié)核病防控的必要工具。目前經(jīng)典的藥物敏感性檢測（DST）耗時長（2-4周），而市場上主流的線性探針技術(shù)（LPA）、Xpert等MDR-TB檢測技術(shù)僅對目前已知的異煙肼（isoniazid，H）和/或利福平（rifampicin，R）的耐藥經(jīng)典位點進行檢測，可能出現(xiàn)一定程度的漏檢［6］，均不適宜未來口岸的防控需求。全基因組測序（WGS）技術(shù)可對結(jié)核菌株耐藥突變位點檢測全面覆蓋，且具有準確、高通量等優(yōu)點［6］。本研究應(yīng)用WGS技術(shù)對2008-2018年廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核生物樣本庫中的MDR-TB相關(guān)菌株進行檢測，并綜合患者流行病學(xué)及治療情況，探索單末端（SE）50WGS-NDA納米微球（DNB）技術(shù)在口岸MDR-PTB檢測方面應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料收集

本研究收集整理2008-2018年廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核生物樣本庫中的結(jié)核臨床分離耐藥菌株（HR、RR、MDR和XDR）92株，按照2∶1比例隨機抽取庫中敏感菌株46株。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種復(fù)蘇

138株結(jié)核生物樣本庫保藏菌株，取0.5mL接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃孵育箱培養(yǎng)數(shù)周。挑取生長菌落進行抗酸染色（抗酸染色液，珠海貝索）及MPB64蛋白（結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒，杭州創(chuàng)新）快速初步鑒定。TB/NTM混合生長、液化或生長狀態(tài)不佳菌株者棄之。待肉眼可見有良好菌落生長時，挑取適量菌落分別進行BD960液體比例法藥敏試驗和LPA分子藥敏檢測，進一步確認菌株的藥敏檢測結(jié)果。

1.2.2 藥敏試驗

1.2.2.1 BD960液體比例法 培養(yǎng)基中藥物的最終濃度。一線藥物：鏈霉素（Streptomycin，Sm）1.0μg/ml；異煙肼（isoniazid，H）0.1μg/ml；利福平（rifampicin，R）1.0μg/ml；乙胺丁醇（ethambutol，E）5.0μg/ml；丙嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）5.0μg/ml。二線藥物：氧氟沙星（ofloxacin，OFX）2.0μg/ml；阿米卡星（amikacin，AK）1.0μg/ml；卷曲霉素（capreomycin，CPM）2.5μg/ml；乙硫異煙胺（ethionamide，ETH）5.0μg/ml；對氨基水楊酸（paraaminosalicylicacid，PAS）4.0μg/ml。分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏試驗培養(yǎng)管和BD960儀器由美國BD公司生產(chǎn)。

1.2.2.2 分子藥敏檢測法 采用熱裂解法提取上述藥敏試驗對照管菌株DNA，進行LPA（gene type MTBDRplus試劑盒，HainLifescience公司）檢測，對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和異煙肼、利福平耐藥實施分子鑒定和藥敏檢測，此法以下簡稱基因型藥敏。DST表型藥敏結(jié)果與LPA基因型藥敏結(jié)果不一致的菌株實施重復(fù)2次的WGS檢測。

1.2.2.3 結(jié)果確診 經(jīng)上述2種藥敏方法確認，無法鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）或無法完成藥敏試驗，棄之；菌株耐藥性若發(fā)生改變，以復(fù)蘇后確認結(jié)果為準。

1.2.3 定義

采用BD960液體比例法對結(jié)核分枝桿菌菌株進行DST，僅對H耐藥的結(jié)核菌株稱為單耐異煙肼結(jié)核（HR-MTB）；僅對R耐藥的結(jié)核菌株稱為單耐利福平結(jié)核（RR-MTB）；同時對H和R耐藥的結(jié)核菌株稱為MDR-MTB；在MDR-MTB的基礎(chǔ)上，再加上對氟喹諾酮類藥物及二線注射類藥物中任意一種藥物耐藥的結(jié)核菌株稱為廣泛耐藥結(jié)核（XDRMTB）。

1.2.4 WGS檢測

1.2.4.1 DNA提取

納入研究的結(jié)核耐藥和全敏感菌株，提取細菌基因組DNA（細菌DNA提取試劑盒，Magen），詳見試劑盒說明書。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Qubit分析儀對提取細菌基因組DNA進行質(zhì)量控制。

1.2.4.2 DNB-WGS檢測

采用華大智造MSP100文庫制備儀和SEQ50基因測序儀進行SE50單末端測序，按照5ng起始量，以H37Rv（NC_018143.2）標(biāo)準株作為耐藥敏感株進行對照測序，采用Aglient2100對制備的文庫進行質(zhì)量控制，每株耐藥結(jié)核菌至少同時重復(fù)測序2次。當(dāng)每個測試Q30≧75%，total reads≧200M，SplitRate≧85%時，測序原始數(shù)據(jù)認為可用于下一步分析，SNP突變閾值線設(shè)定為90。

1.2.5 結(jié)果分析

使用Excel工作表收集DST表型和LPA分子藥敏試驗結(jié)果，對常見的耐藥相關(guān)位點rpsL、katG、inhA、oxyR-ahpC、rpoB、embB、pncA、gyrA、gyrB、tlyA、rrs進行測序，采用抗生素綜合檢索數(shù)據(jù)庫（CARD）進行耐藥比對分析，所有表型全敏感菌株中均出現(xiàn)某一突變，或某突變占全敏感株≤10%，本研究將其表征為良性突變；耐藥菌株若僅單出現(xiàn)上述突變位點，那么WGS分析結(jié)果時則將其予以剔除，但以上突變我們會將其作為導(dǎo)致耐藥決定突變的潛在源進行進一步重復(fù)分析［6］；與耐藥尚存有疑義的突變，本研究將其列入耐藥分析。以BD960液體比例法DST結(jié)果為參考標(biāo)準方法，比對LPA和WGS的耐藥檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的MTB菌株的基本情況

92株耐藥結(jié)核菌經(jīng)復(fù)蘇并驗證藥敏表型特性后，共有78株菌實施WGS檢測。HR菌株28株，分離自28例患者，年齡范圍為15-80歲，平均49.81±19.54歲，男性占71.43%（20/28），分別來自廣東（19）、廣西（5）、遼寧（1）、福建（1）、海南（1）和中國香港（1）。RR菌株14株，分離自3名患者，年齡范圍為31-55歲，平均45.6±12.03歲，男性占2/3，均來自廣東。MDR菌株35株，分離自29例患者，年齡范圍為2-77歲，平均年齡42.59±21.34歲，男性占61.72%（15/29），分別來自廣東（24）、貴州（5）、廣西（1）、河 南（1）、遼 寧（1）、江 西（1）、吉 林（1）、天 津（1）。XDR菌株1株，自1例天津72歲退休女性晨痰中分離。全敏感菌株45株，均分離自臨床PTB疑似患者晨痰，其中標(biāo)準菌株H37Rv共重復(fù)檢測6次（見表1）。

2.2 菌株LPA法檢測結(jié)果

LPA法對78株耐藥菌株進行分子藥敏檢測，未檢出突變率為28.21%，LPA法檢測45株全敏感菌株，除2株檢出rpoB_H526D和rpoB_H526Y突變不納入下一步檢測外，其余檢測結(jié)果與DST表型結(jié)果一致（見表1）。

表1 92株耐藥結(jié)核菌株的基本情況

2.3 WGS制備文庫質(zhì)量控制

WGS每株菌株所制備的文庫均對其擴增PCR片段進行質(zhì)量控制，如14043號樣本（LPA未檢出突變，RR菌株）重復(fù)測序2次，制備的文庫1和文庫2的峰值均在180-300bp之間（見圖1a，b），片段比較集中，與預(yù)期結(jié)果相符。產(chǎn)物濃度＞5ng/μL，可滿足下一步DNB制備要求。

圖1 14043號樣本制備文庫1和文庫2的Aglient2100檢測結(jié)果

2.4 43株全敏感菌株WGS檢測結(jié)果

1株菌株檢出NTM/MTB混合感染。標(biāo)準菌株H37Rv未檢出任意突變。71.43%（30/42）菌株同時檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變。檢出的良性突變有：gyrA_S95T，100%菌株均檢出；thyA_T202A、embC_N394D、embC -T270I、embB_E378A、embC_V981L、embR_C110Y，9.52%（4/42）菌株檢出；gyrA_E20Q、gyrA_G668D、gidB_E94D、embA_P913S、kas_G312S，7.14%（3/42）菌株檢出；embC_R378Q、ndh_V18A和kasA_G269S，2.38%（1/42）菌株檢出。

2.5 WGS與LPA檢測結(jié)果比較

78株耐藥結(jié)核菌株基因突變的LPA和WGS檢測結(jié)果見表2。

表2 LPA與WGS檢測耐藥結(jié)核菌結(jié)果的比較

2.5.1 LPA已檢出突變的56株菌株WGS檢出了13株katG_S315T1、10株rpoB_S531L、25株rpoB_S531L、1株rpoB_D516V和25株katG_S315T突變；WGS未檢出2株InhA_C15T突變 （但檢出1株ahpC_M109L突變），2株rpoB_H526D和2株rpoB_H526Y突變。

2.5.2 LPA未檢出突變的22株菌株

2.5.2.1 WGS檢出了No.2、18和21為NTM/MTB混合感染。

2.5.2.2 WGS檢出了No.10的KatG_S315T突變。

2.5.2.3 No.1，No.2-9和No.11-13共11株HR菌中，WGS均檢出了gyrA_S95T（與突變是否相關(guān)存有疑義［7］）和katG_R463L（與HR相關(guān)存有疑義［7-9］）雙突變，在No.5（來自海南1名30歲女性患者）和No.12（來自2008年WHO能力驗證測試株）中分別檢出了已有研究［10-11］證實的與HR相關(guān)的kas_G312S和katG_S315N突變，在No.12中還檢出了與乙胺丁醇耐 藥 相 關(guān) 的embB_E378A［12-13］，embB_D328Y［11］和embC_T270I［14-15］突變。

2.5.2.4 3株RR No.14-16菌株來自廣東省一例53歲男性患者的初診和治療過程中復(fù)查的2次（療程近3年）痰樣，均檢出gyrA_E21Q、katG_R463L、rpoB_V170F和gidB_E92D多突變，3株菌檢測結(jié)果一致，為MDR-TB的可能性極大。

2.5.2.5 5株MDR No.18和21檢測結(jié)果均為MTB/NTM混合感染。No.17、19和20均檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變，No.20還檢出RR相關(guān)rpoB_S450L、E耐藥相embB_M306V［10］、S耐藥相關(guān)rpsL_K43R和PZA耐藥相關(guān)pncA_P54L等多突變，與表型耐藥檢測結(jié)果一致。

2.5.2.6 1株XDR No.22檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變。

3 討論

WGS技術(shù)應(yīng)用于臨床MDR-TB的診斷時代正在開啟，但以往研究尚存在對于特定基因突變是否與耐藥關(guān)聯(lián)明確性不足的問題，因此該技術(shù)應(yīng)用于臨床的準確性和可行性仍有待進一步評估［15］。在臨床測序檢測的前中后整個過程中，如何進行菌株質(zhì)量、測序文庫和海量測序數(shù)據(jù)與臨床表型耐藥信息的有效對接分析等質(zhì)量控制工作，以確保實驗結(jié)果滿足口岸臨床檢測快、準、穩(wěn)的多項需求，是一項富有挑戰(zhàn)性的工作。本研究以口岸十多年積累的結(jié)核生物樣本庫［16］菌株為材料，選取SE50 WGS技術(shù)為平臺，運用全程質(zhì)控理念，緊密結(jié)合患者臨床資料進行綜合分析，以期在以往大多以菌株本身作為研究對象進行的耐藥突變位點的研究基礎(chǔ)上，探索出一個適合口岸MDR-TB WGS的檢測技術(shù)平臺。

臨床結(jié)核菌WGS檢測結(jié)果的準確，首先在于嚴格控制臨床分離菌株的菌體質(zhì)量。本研究以生物樣本庫復(fù)蘇的菌株作為模擬樣本，從其生長狀態(tài)、鏡下形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)方法鑒定、表型和分子藥敏試驗等多維度進行綜合質(zhì)量評估。NTM或其它雜菌污染可能導(dǎo)致WGS菌種鑒定和耐藥分析的失敗，因此在WGS檢測前，檢測技術(shù)人員應(yīng)盡可能選取生長狀態(tài)良好的純菌進行檢測，以確保后續(xù)檢測結(jié)果的有效性和準確性。其次，為保證菌株藥敏特性的可比性，本研究對每一株復(fù)蘇菌株進行了嚴格的表型和分子藥敏特征確認。我們發(fā)現(xiàn)HR和RR菌株中分別有7株（1/5）和1株（1/15）菌耐藥特性由耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾校鳰DR和XDR菌株的耐藥性相對穩(wěn)定，未發(fā)生變化。表型藥敏比例法規(guī)定≥1%的分離株在臨界藥物濃度中生長則判為該菌株耐藥，若排除人為操作原因?qū)е碌牟町?，HR和RR菌株耐藥性發(fā)生變化可能是菌株本身即為耐藥/敏感混合型菌株，在不同的檢測中所取到的耐藥/敏感菌比例不同所導(dǎo)致的檢測結(jié)果不同。LPA分子藥敏確認結(jié)果顯示，其對H和R的耐藥基因突變漏檢率高達1/3（22/78），這與試劑盒本身設(shè)計有關(guān)，因此該法用于未來口岸耐多藥結(jié)核檢測并不是最佳選擇。

結(jié)核病耐藥機制非常復(fù)雜，目前較為公認的機制理論是MTB基因突變導(dǎo)致藥物靶標(biāo)發(fā)生變化，使藥物無法結(jié)合變異的靶位。結(jié)核表型DST檢測技術(shù)發(fā)展緩慢，操作人員技術(shù)要求高，操作流程復(fù)雜，某些情況下檢測結(jié)果還有可能存在不可靠，因此快速精準的分子檢測技術(shù)將成為未來的發(fā)展方向。鑒于商售分子檢測技術(shù)存在的各種問題，WGS技術(shù)將為MDR-TB快速準確檢測開辟一條新的道路，目前其主流有基于合成測序法的Hiseq、連接測序法的SOLiD和以聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS）及DNA納米球（DNB）為核心技術(shù)的三大類測序平臺。本研究選取國產(chǎn)平臺的后者為基礎(chǔ)，采用單末端50bp讀長，測序深度為50X，進行結(jié)核單菌WGS檢測，整體檢測及分析時間（Turn around Time，TAT）約為30h，隨著測序儀器性能和便攜性的進一步提升，TAT可縮減至24h內(nèi)，雖與目前商售分子藥敏檢測3-6h相比，還有更進一步的空間，但其具有高通量和突變檢測覆蓋全，可進行追蹤傳播鏈等［17］的優(yōu)點，一旦耐藥突變與臨床患者真實情況可以準確對接并互譯，那么其在未來結(jié)核病綜合防控中將具有良好的應(yīng)用前景。

WGS臨床檢測的成敗和優(yōu)劣，制備文庫的質(zhì)量，測序數(shù)據(jù)的步步有效篩選和WGS軟件解讀突變與臨床菌株耐藥結(jié)果的有效匹配性是整個檢測的關(guān)鍵與難點。本研究發(fā)現(xiàn)影響文庫制備的好與壞，主要在于酶切和建庫方法的選擇。我們對酶的組分和打斷方式（體積、溫度和時間）進行優(yōu)化，建庫方式選取儀器法，最終構(gòu)建的文庫穩(wěn)定性和質(zhì)量明顯優(yōu)于手工法。獲取WGS下機數(shù)據(jù)后，本研究將首先對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量分析，soapnuke數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾后，與MTB標(biāo)準菌株及NTM菌株參考序列進行序列比對進行菌種鑒定，再經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾、組裝，進而與CARD耐藥數(shù)據(jù)庫比對，統(tǒng)計整理有意義耐藥突變信息，最后基于文獻報道及臨床試驗數(shù)據(jù)進行基因預(yù)測。

結(jié)核患者在治療期間或出現(xiàn)耐藥后，常發(fā)生NTM/MTB混合感染，這時實驗室常常因為NTM與MTB性狀相似導(dǎo)致難以分離出純結(jié)核菌，致使DST表型和常規(guī)分子檢測失敗或結(jié)果不準確。本研究設(shè)定當(dāng)結(jié)核單菌中混雜NTM量超過5%時，鑒定為MTB/NTM混合感染，本研究共檢出4例NTM/MTB混合感染菌株，為臨床醫(yī)師確定后續(xù)治療方案提供了更為全面的輔診證據(jù)。目前本研究平臺一旦鑒定出NTM/MTB混合感染菌株，則終止后續(xù)耐藥分析，原因在于所獲數(shù)據(jù)量不足以支持后續(xù)分析，今后我們將進一步優(yōu)化檢測與分析系統(tǒng)，在文庫構(gòu)建前將起始DNA的投入量增大20-40倍至100-200ng，以達到對目標(biāo)菌耐藥性進行有效分析的目的。

MDR-TB兩種抗結(jié)核藥物H和R，H是一種抗結(jié)核藥物前體，需通過katG編碼的觸酶過氧化物酶活化產(chǎn)生游離的自由基，然后其攻擊細胞內(nèi)的多個藥物靶點發(fā)揮藥效。當(dāng)katG基因（編碼的觸酶過氧化物酶是唯一能活化異煙肼前體的酶）發(fā)生點突變（突變頻率為50%-80%）、堿基缺失或者插入時，觸酶過氧化物酶活性下降或喪失，組織H變成活性形式，從而使MTB對H產(chǎn)生不同程度的耐藥［18］。HR高水平耐藥以katG_S315T突變?yōu)橹?，低水平耐藥inhA突變（突變頻率為15%-43%）為輔，inhA突變又以啟動子區(qū)-15（C→T）突變?yōu)橹鳎?9］，控制解毒酶基因編碼oxyR-ahpC基因的突變也會導(dǎo)致HR的發(fā)生，其突變頻率為10%-15%。目前商售檢測試劑突變位點的覆蓋率總體為70%-90%，少有覆蓋ahpC基因突變。抗結(jié)核藥物R，通過與rpoB基因編碼的細菌RNA聚合酶β-亞基結(jié)合，干擾、抑制細菌RNA的合成，抑制細菌的生長繁殖，導(dǎo)致細菌的死亡。rpoB基因的單個堿基突變或數(shù)個堿基聯(lián)合突變或堿基的插入和缺失共30多種，突變常發(fā)生于在507-533位點間，以S511L、A516V、H526A、H526D、S531L突變?yōu)槌Ｒ姟?/p>

本研究構(gòu)建的WGS SE50檢測平臺系統(tǒng)對結(jié)核耐藥常見基因突變katG_S315T1、rpoB_S531L等均穩(wěn)定檢出。常規(guī)近七成LPA分子藥敏無法檢出突變的菌株中，我們在HR、MDR和XDR菌株中均同時檢出了gyrA_S95T和KatG_R463L雙突變，在3株LPA未檢出突變的RR菌株中檢出了KatG_R463L突變，雖然KatG_R463L突變是否為H的耐藥決定性突變還存在爭議，但gyrA_S95T和KatG_R463L雙突變是否存在協(xié)同作用，KatG_R463L與其它突變以期致菌株成為MDRTB，有一定的可能性，我們需要后續(xù)更進一步的研究去證實。LPA法無法檢出來自同一患者治療前后的3株RR菌株，除檢出KatG_R463L突變外，還檢出了與氟喹諾酮類耐藥相關(guān)的gyrA基因E21Q和G668D突變，與RR相關(guān)且常發(fā)生在北京株的rpoB_V170F［16］和與抗結(jié)核二線注射類藥物相關(guān)的gidB_E92D突變，上述突變的存在可能與患者的難治性相關(guān)。對于LPA未檢出突變的20號MDR菌株，WGS檢出的突變可以很好地解釋其表型耐藥結(jié)果。對于LPA未檢出突變的XDR菌株，WGS檢出了gyrA_S95T和katG_R463L雙突變，這進一步說明上述兩突變對于結(jié)核耐多藥及以上程度耐藥的良好的預(yù)測作用。對于HR低水平耐藥突變inhA_C15T和rpoB526位點突變，因尚未將其納入分析范疇而致漏檢，未來的研究中我們將在現(xiàn)有基礎(chǔ)之上，不斷完善耐藥解讀庫，使之與臨床匹配度不斷增高。

2020年中國防新冠疫情最有效的措施便是隔離，如果未來口岸能通過WGS檢測及時有效發(fā)現(xiàn)攜帶MDR-TB的旅行者，就有可能及時執(zhí)行隔離措施，防止MDR-TB的擴散。