李曉宗 胡燕 吳平 宋云端

（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗科，上海 201300）

現(xiàn)代醫(yī)療儀器及耗材在臨床檢驗中大量使用，并對檢驗質(zhì)量造成深刻影響。真空采血管是一種檢驗科大量使用的耗材，血液采集和分離是臨床生化檢驗中極為重要的一環(huán)，影響著檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［1］。1990～2017年，糖尿病在中國疾病負(fù)擔(dān)的位次從第19位上升到第8位［2］，糖尿病患者的診斷和風(fēng)險評估依賴于葡萄糖濃度的準(zhǔn)確檢測，隨著檢測方法學(xué)進步和試劑標(biāo)準(zhǔn)化，血糖檢測的準(zhǔn)確度和精密度大大提高，這時由糖酵解造成的分析前誤差逐漸成為葡萄糖檢測誤差的主要原因［3］。目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室均采用《全國臨床檢驗操作規(guī)程》推薦的含有糖酵解抑制劑氟化鈉的葡萄糖專用采血管采集、保存、轉(zhuǎn)運血糖標(biāo)本，但越來越多的研究證實由于氟化鈉起效較慢，不能及時抑制標(biāo)本內(nèi)葡萄糖的糖酵解反應(yīng)，導(dǎo)致檢測值和真實值之間出現(xiàn)偏差［4］，因此美國糖尿病學(xué)會（American Diabetes Association，ADA）和美國臨床生物化學(xué)學(xué)會（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）在2011年發(fā)布的血糖標(biāo)本采集指南中推薦使用檸檬酸酸化管替代氟化鈉管。目前存在的問題是檸檬酸酸化血糖管亟待標(biāo)準(zhǔn)化，也缺乏分析性能方面的可靠性驗證，使用檸檬酸酸化管后現(xiàn)有血糖參考區(qū)間和診斷閾值也需要重新評估及驗證［5，6］，酸化管的推廣還存在一定障礙。冰水法一直作為ADA和NACB推薦方法用于血糖體外保存的研究，其要求標(biāo)本采集后立即放入冰水中并在30min內(nèi)完成血漿和細胞的分離，但這一方案實用性較差?，F(xiàn)對該方法進行了適當(dāng)改良，并采用基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范來判斷其保存血糖的效果，報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 真空采血管

廣州陽普醫(yī)療科技有限公司提供，肝素鋰采血管（Φ13×75，批號：176898），EDTAK2－氟化鈉采血管（Φ13×75，批號：178798）。

1.1.2 儀器與試劑

分析儀器為ADVIA2400全自動生化分析儀。試劑由Siemens－Bayer公司生產(chǎn)，批號為439419，檢測方法為己糖激酶法，定標(biāo)品為試劑配套，批號135808B。室內(nèi)質(zhì)控品由Beckman公司提供，低、中、高值批號分別為M701051、M701052、M701053。標(biāo)本測定前，進行質(zhì)控品的測定，質(zhì)控通過后再進行樣本的測定，同時加測質(zhì)控品，兩次質(zhì)控結(jié)果均符合要求則樣本測定結(jié)果有效。

1.1.3 冰水混合物容器

由小型標(biāo)本轉(zhuǎn)運箱進行簡易改裝而成，冰塊為實驗室自行制備。放置一試管架于轉(zhuǎn)運箱內(nèi)，冰塊放置試管架周圍，加水使液面距試管架頂端2cm處。肝素鋰管使用前放于箱內(nèi)預(yù)冷不少于30min，標(biāo)本采集時由箱內(nèi)取用，標(biāo)本采集完畢并標(biāo)注編號信息后迅速放回箱內(nèi)保存。

1.2 方法

20名自愿者由門診患者中招募，其中男9名，女11名，年齡45±11.5歲（26～66歲），無貧血及已知重大器官疾病、腫瘤、血液、免疫性疾病，血常規(guī)檢查白細胞、紅細胞壓積正常。自愿者取坐姿由3名經(jīng)驗豐富的護士同時采血，標(biāo)本采集遵照《樣本采集手冊標(biāo)本》規(guī)定程序。自愿者使用預(yù)冷肝素鋰采血管連續(xù)采血4份，每份3ml，采集后立即放于轉(zhuǎn)運箱內(nèi)的試管架上（肝素鋰管冰水組）；使用EDTAK2－氟化鈉管連續(xù)采血3份，每份采血為3ml，采集后放置試管架室溫（25℃）保存（EDTAK2－氟化鈉管室溫組）。每位自愿者標(biāo)本采集完成后即刻取1份肝素鋰管標(biāo)本立即離心分離血漿并上機檢測，檢測值作為基準(zhǔn)值。然后分別在30、60、120min后按照自愿者標(biāo)本編號在兩組中隨機取1份離心檢測。所有標(biāo)本離心均在中國湘儀公司KH120R低溫離心機進行，溫度設(shè)定為4℃，2500×g離心15min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Graphpad Prism 7.0軟件包進行統(tǒng)計分析及繪圖。符合正態(tài)分布實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以WESTGARD網(wǎng)站最新公布的個體內(nèi)生物變異（CVi）與個體間生物變異（CVG）計算血漿葡萄糖實驗室檢測的最低、適當(dāng)和最佳的質(zhì)量指標(biāo)，最低質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.75CVi＋0.375（CVi2＋CVG2）0.5＝8.32%；適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.5CVi＋0.25（CVi2＋CVG2）0.5＝5.90%；最佳質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.25CVi＋0.125（CVi2＋CVG2）0.5＝2.64%，并以此標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果是否可以被臨床接受。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測結(jié)果及比較

肝素鋰管冰水組和EDTAK2－氟化鈉管室溫組標(biāo)本放置30、60、120min后離心檢測，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布，以表示（見表1）；兩組各時間點檢測值均隨著時間延長出現(xiàn)進行性下降，放置相同時間EDTAK2－氟化鈉管室溫組較肝素鋰管冰水組

表1 標(biāo)本放置0、30、60、120min后血糖測定結(jié)果（，mmol／L）

注：與基準(zhǔn)值比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

下降更為明顯；肝素鋰管標(biāo)本在冰水中放置30、60min血糖檢測值和即刻檢測值進行配對t檢驗，P值分別為0.1670、0.0553，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。肝素鋰管冰水組120min、EDTAK2－氟化鈉管室溫組30、60、120min血糖檢測值與基準(zhǔn)值比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 兩組檢測結(jié)果偏差與質(zhì)量指標(biāo)的比較

肝素鋰管冰水組30、60、120min檢測結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差分別為－0.25%、－0.64%、－2.54%。EDTAK2－氟化鈉管室溫組30、60、120min檢測結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差分別為－3.67%、－6.07%、－7.76%（見圖1）。以WESTGARD網(wǎng)站最新公布的個體內(nèi)生物變異（CVi）與個體間生物變異（CVG）計算出的血漿葡萄糖實驗室檢測最低、適當(dāng)和最佳的質(zhì)量指標(biāo)衡量：（1）肝素鋰管冰水組30、60、120min檢測結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差均小于最佳質(zhì)量指標(biāo)；（2）EDTAK2－氟化鈉管室溫組30min檢測結(jié)果介于最佳和適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)之間；（3）EDTAK2－氟化鈉管室溫組60、120min檢測結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差大于適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)。

圖1 標(biāo)本放置30、60、120min后離心血糖測定結(jié)果與基準(zhǔn)值偏差

3 討論

實驗耗材是專業(yè)院校或醫(yī)療單位的檢驗檢測部門、第三方的獨立檢驗檢測機構(gòu)以及其他的實驗室開展實驗工作的常用物品。隨著醫(yī)療過程安全性與便捷性越來越受到重視，耗材逐漸在醫(yī)療技術(shù)的應(yīng)用過程中發(fā)揮出更大的作用，尤其是醫(yī)學(xué)檢驗項目的完成，必須依賴很多實驗室耗材才能實現(xiàn)準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

血糖是糖尿病診斷和治療監(jiān)測最為重要的指標(biāo)，但由糖酵解造成的檢驗前誤差始終困擾著臨床血糖檢測［7］。糖酵解是指葡萄糖在無氧或缺氧的條件下分解為乳酸的同時產(chǎn)生少量ATP的過程，反應(yīng)溫度和酶活性可以顯著影響包括糖酵解反應(yīng)在內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程，因此抑制糖酵解反應(yīng)中參與酶的活性和降低溫度都可以抑制、降低糖酵解的反應(yīng)進程。

氟化鈉作為添加劑在臨床廣泛使用，但因為氟化鈉所作用的烯醇酶位于糖酵解過程中的最后階段且為非限速酶，導(dǎo)致其4h以后才能完全發(fā)揮作用［8］。在以往的文獻報道中，一般都是在標(biāo)本采集后立即進行了血漿的分離檢測，從而得出氟化鈉是保護血糖的良好添加劑的結(jié)論，但標(biāo)本離心分離前在室溫下留置的這個時間段往往被忽視。據(jù)張吟眉［9］等報道，離心前的草酸鈉－氟化鈉采血管中的葡萄糖濃度隨放置時間增加而降低，王路等［10］報道氟化鈉抗凝管離心前、后放置血糖測定值有差異，放置2h后平均相差0.667mmol／L；氟化鈉另外一個重要的缺點是它對紅細胞的完整性破壞較為嚴(yán)重［11］，因此在2011年ADA和NACB發(fā)布的血糖標(biāo)本采集指南中推薦在采血管中加入檸檬酸替代氟化鈉添加劑。檸檬酸緩沖液可以使反應(yīng)體系的pH值降低為5.5，抑制了糖酵解反應(yīng)初始階段的限速酶——己糖激酶，使糖酵解在初始階段即被終止，一些文獻也表明檸檬酸管對血糖的穩(wěn)定作用大大優(yōu)于氟化鈉管，溶血狀況也得到了改善［12，13］。但亦有文獻研究指出采用檸檬酸添加劑后現(xiàn)有的糖尿病診斷閾值、參考區(qū)間還需要大量臨床數(shù)據(jù)的重新評估及驗證［14］，大規(guī)模臨床應(yīng)用尚存在障礙。溫度對酶活性有顯著影響，所以溫度也是決定酶催化化學(xué)反應(yīng)速率的關(guān)鍵因素，溫度降低酶促反應(yīng)減弱或停止，溫度升高反應(yīng)速度加快［15］。糖酵解反應(yīng)作為一種酶催化化學(xué)反應(yīng)，溫度降低可以顯著降低糖酵解反應(yīng)。血糖標(biāo)本放入冰水混合物后，由于冰水的物理降溫作用，使標(biāo)本溫度降低，糖酵解進程減緩，標(biāo)本內(nèi)葡萄糖的“損耗”減少。有研究表明，血液進入采血管后其溫度從體溫降至0℃需要10min左右［16］，因此該研究在標(biāo)本采集前即對采血管進行了預(yù)冷卻處理，使標(biāo)本溫度降低得更為迅速，減少糖酵解作用對標(biāo)本內(nèi)血糖的損耗?；谏飳W(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范是處于1999年“建立全球檢驗醫(yī)學(xué)分析質(zhì)量規(guī)范策略”會議協(xié)商決定的目前質(zhì)量規(guī)范五級層級模式中的第二級，它著重考慮了臨床檢驗結(jié)果主要用于疾病監(jiān)測和診斷的醫(yī)學(xué)需求［17］，優(yōu)于目前大多數(shù)臨床實驗室采用的處于質(zhì)量規(guī)范層級模式中第4級的美國臨床實驗室修正法規(guī)（CLIA′88），所以選用了基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范來評價本次試驗中血糖的偏差。實驗表明，改良冰水法能夠在2h內(nèi)有效“保護”血糖，標(biāo)本檢測平均偏差小于基于生物學(xué)變異的最佳質(zhì)量指標(biāo)，能夠被臨床接受。該研究篩選自愿者時排除了白細胞升高、紅細胞壓積不在正常范圍者，對于此類患者的血糖標(biāo)本使用冰水法保存其效果是否理想還需要進一步研究。

4 結(jié)論

研究表明，真空采血管進行了預(yù)冷處理后其對血糖標(biāo)本中血糖的保護作用明顯提升，在不增加耗材成本的基礎(chǔ)上提高了血糖檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗表明，氟化鈉添加劑采血管采集葡萄糖標(biāo)本后如不能及時離心檢測其結(jié)果用于臨床診斷及病情判斷并不可靠，容易造成不良醫(yī)學(xué)后果。改良冰水冷卻法可以在2h內(nèi)有效保存葡萄糖標(biāo)本，可以被臨床接受，進一步完善后可用于離心前血糖標(biāo)本的保存。