譚小艷，馬耀華，郝兆祥

(1 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊，277160；2 棗莊市石榴研究中心，山東棗莊，277300)

石榴為落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗和印度等西亞地區(qū)，現(xiàn)在世界各地廣泛栽培[1]。近年來(lái)，石榴種質(zhì)資源及其分子標(biāo)記的研究[2-5]、石榴重要性狀基因的克隆[6-8]、EST文庫(kù)的構(gòu)建成為石榴分子生物學(xué)研究方面的熱點(diǎn)。而高質(zhì)量DNA、RNA的提取是分子生物學(xué)研究的必要步驟。幼嫩葉片DNA提取的研究有較多報(bào)道[9-11]，但石榴成熟葉片的DNA提取方法的報(bào)道較少[4，12-13]，且獲得的DNA產(chǎn)量低，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)率較低，對(duì)石榴種質(zhì)資源研究和其他分子生物學(xué)操作帶來(lái)很大的不便。從幼嫩、新鮮葉片中提取DNA材料，受季節(jié)限制而取樣時(shí)間短。由于成熟石榴葉片中多糖和酚類(lèi)物質(zhì)[9，14]較幼嫩組織中多，這些物質(zhì)與DNA結(jié)合程度較高，增加了DNA的提取難度。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)常用于植物DNA提取方法——CTAB提取法，進(jìn)行多次改良研究，探討適合石榴成熟葉片DNA提取的方法，為石榴種質(zhì)資源及分子生物學(xué)方面的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以成熟石榴葉作為實(shí)驗(yàn)材料，材料來(lái)源于嶧城中國(guó)石榴種質(zhì)資源圃，于2018年8月采集(見(jiàn)表1)，冷凍保存于-80 ℃冰箱。

表1 石榴葉片編號(hào)、品種、花色

1.2 石榴葉片基因組DNA的提取

從采集的20個(gè)石榴品種葉片中抽取前5個(gè)品種進(jìn)行研究。

1.2.1 改良CTAB Ⅰ法 此方法參考趙麗華等人優(yōu)化的DNA提取方法Ⅱ[12]。①取2 g石榴葉片放入預(yù)冷的研缽中，加入0.02 g抗壞血酸(Vc)和0.05 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)于研缽中，用液氮將研缽預(yù)冷，將除去葉脈的葉片放入研缽中，加入液氮將葉片快速研磨至粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入冰浴的CTAB緩沖液4 mL，混勻，冰浴10 min，在4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，收集沉淀。②在沉淀中加入65 ℃預(yù)熱CTAB裂解液4 mL，混勻，65 ℃水浴30 min，中間輕柔振蕩3次，放氣1次。③在溶液中加入5 mol/L KAc 1 mL，混勻，冰浴20 min。④加入4 mL氯仿∶異戊醇= 24∶1，輕柔顛倒混勻，乳化10 min，于20 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新離心管中，此步驟再重復(fù)一次。⑤對(duì)以上所得溶液分別加入1/5體積的3 mol/L NaAc及等體積-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冰上沉淀30 min；于室溫、12 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，將沉淀轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，用75%乙醇漂洗5 min，重復(fù)1次，再用無(wú)水乙醇漂洗5 min，沉淀置于室溫下干燥至無(wú)酒精味；加入100 μL TE溶解沉淀，進(jìn)行DNA純化或放入-20 ℃冰箱備用。⑥在粗提DNA溶液中分別加入5 μL RNase A，37 ℃水浴40 min，電泳查看RNA是否除凈。⑦向除凈RNA的DNA溶液中補(bǔ)加400 μLTE，加入500 μL酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，顛倒混勻5 min，靜置10 min。⑧20 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新離心管中；補(bǔ)加TE至總體積500 μL，加入4 mL氯仿∶異戊醇= 24∶1，輕柔顛倒混勻，乳化10 min，20 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新離心管中，再重復(fù)1次。⑨向粗提DNA中加入5 mol/L NaCl，使溶液中的NaCl最終濃度為2 mol/L，再加入1.5倍體積-20 ℃預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，冰上沉淀30 min；于室溫、10 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，將沉淀轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中；用75%乙醇漂洗5 min，重復(fù)1次，再用無(wú)水乙醇漂洗5 min，沉淀置于室溫下干燥至無(wú)酒精味；加入100 μL TE溶解沉淀，放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 改良CTAB Ⅱ法 改良CTAB Ⅱ法在改良CTAB Ⅰ的基礎(chǔ)上改進(jìn)：將步驟①中的冰浴的CTAB緩沖液改為65 ℃水浴的CTAB緩沖液，放棄冰浴和離心過(guò)程；步驟⑤中不加入1/5體積的3 mol/L NaAc，只加等體積-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇。其余步驟同CTAB Ⅰ方法。

1.2.3 改良CTAB Ⅲ法 改良CTAB Ⅲ法在改良CTAB Ⅱ的基礎(chǔ)上改進(jìn)，在步驟①加入適量石英砂，提高快速研磨能力。步驟②與上述CTAB Ⅰ步驟②相同。③取出樣品管，冷卻片刻(可置于冰上)，加入等體積的氯仿∶異戊醇(V∶V=24∶1)，劇烈震蕩幾下樣品管，10 000 rpm，4 ℃，離心l0 min，取上清液。重復(fù)抽提1次。④加入2/3體積上清液的預(yù)冷異丙醇(-20 ℃)，冰上沉淀30 min后，用滅菌玻璃鉤輕輕勾出DNA沉淀。⑤DNA沉淀轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管并加適量(約100～200 μL)高鹽TE緩沖液溶解，如不能完全溶解，可65 ℃水浴10 min。⑥加入2 μL的RNase酶，37 ℃溫浴30 min。⑦同CATB Ⅰ中步驟③，但需要輕柔顛倒混勻。⑧同CATB Ⅰ中步驟⑧。⑨DNA沉淀用70%～75%乙醇漂洗5 min，重復(fù)1次，再用無(wú)水乙醇漂洗5 min，置于超凈臺(tái)上干燥至無(wú)酒精味，溶解于滅菌的TE溶液中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 改良CTAB Ⅳ法 對(duì)改良CTAB Ⅲ法進(jìn)行改進(jìn)，將離心溫度由4 ℃設(shè)置為15 ℃。其余步驟同CTAB Ⅲ。

1.3 石榴基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)方法

1.3.1 DNA純度和產(chǎn)率的紫外檢測(cè) 取純化后的待測(cè)DNA 3 μL，加無(wú)菌水57 μL，混勻后轉(zhuǎn)入石英微量比色皿，用紫外分光光度法檢測(cè)DNA的含量，檢測(cè)260、280 nm處的OD值，計(jì)算得出DNA的含量與純度。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)DNA的完整性 根據(jù)上述1.2.4法所述改良CTAB Ⅳ法提取20個(gè)品種石榴葉片的總DNA，利用UBC811堿基隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，查看DNA純度。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中引物(10 μmol/ L)1 μL，Premix Ex TaqTM12.5 μL，模板DNA (約25 ng/L) 1 μL，剩余體積用ddH2O來(lái)補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，51.2 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，穩(wěn)壓5 cm/V。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴基因組DNA的提取結(jié)果分析

2.1.1 4種提取方法DNA的檢驗(yàn) 改良CTAB Ⅰ法提取的DNA有降解現(xiàn)象，且DNA的濃度不高。改良CTAB Ⅱ法提取DNA獲得的DNA譜帶，加樣孔有亮點(diǎn)，并且有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取的DNA樣品被多糖或者蛋白雜質(zhì)污染并有降解現(xiàn)象。改良CTAB Ⅲ法提取DNA雖然純度較高，但濃度不高。利用改良CTAB Ⅳ法提取DNA獲得的DNA譜帶，電泳時(shí)加樣孔干凈，無(wú)拖帶降解現(xiàn)象，DNA純度、濃度較高(見(jiàn)圖1)。

注：M：BM8000 DNA Marker；數(shù)字編號(hào)對(duì)應(yīng)品種名稱(chēng)與表1相同。

2.1.2 DNA純度和濃度的測(cè)定 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定改良CTAB法(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)提取DNA的OD260和OD280吸收值，并計(jì)算OD260/OD280的比值，分析DNA的純度和濃度。結(jié)果表明：改良CTAB Ⅰ法提取DNA的OD260/OD280比值均小于1.8，且DNA濃度不高(見(jiàn)表2)；改良CTAB Ⅱ、改良CTAB Ⅲ法提取DNA的OD260/OD280比值大部分小于1.8，DNA濃度較低(見(jiàn)表3、表4)。說(shuō)明這3種方法提取的DNA不純，含有較多的蛋白質(zhì)或酚類(lèi)物質(zhì)。CTAB Ⅳ法提取的DNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，即提取的DNA純度較高，經(jīng)計(jì)算CTAB Ⅳ法獲得DNA的濃度也較高(見(jiàn)表5)。

表2 改良CTAB Ⅰ法DNA的純度及濃度

表3 改良CTAB Ⅱ法DNA的純度及濃度

表4 改良CTABⅢ法DNA的純度及濃度

表5 改良CTAB Ⅳ法DNA的純度及濃度

2.2 ISSR標(biāo)記引物的ISSR-PCR電泳結(jié)果

利用UBC811隨機(jī)引物對(duì)用改良CTAB Ⅳ法提取的20種石榴葉片DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，從擴(kuò)增基因組DNA的圖譜上可以看出(見(jiàn)圖2)，除部分樣品加樣失誤而無(wú)擴(kuò)增外(8號(hào)、15號(hào))，其余樣品DNA經(jīng)ISSR擴(kuò)增多態(tài)性良好，擴(kuò)增總條帶數(shù)目22個(gè)，多態(tài)性條帶數(shù)目15個(gè)，多態(tài)性比率為93.6%，片段大小約200～2 000 bp。這表明，改良CTAB Ⅳ法提取的基因組總DNA能較好地進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究以中國(guó)石榴種質(zhì)資源圃石榴成熟葉片為材料，采用改良CTAB法(Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ)提取石榴基因組DNA，結(jié)果表明：用改良的CTAB Ⅳ 法能夠提取基因組總DNA，其完整性和純度較好、濃度較高，其質(zhì)量、產(chǎn)量都高于其他改良CTAB法。以20個(gè)品種石榴基因組DNA為模板，使用改良的CTAB Ⅳ 法提取的DNA進(jìn)行石榴ISSR-PCR擴(kuò)增，ISSR結(jié)果多態(tài)性好，表明此方法提取的石榴成熟葉片基因組總DNA完全適于ISSR分析。因此，采用改良的CTAB Ⅳ 法是提取石榴成熟葉片DNA 的較佳方法，可獲得成熟石榴葉片中高質(zhì)量基因組DNA。

注：M：100 bp DNA ladder；數(shù)字編號(hào)對(duì)應(yīng)品種名稱(chēng)與表1相同。