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        采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中酚類代謝的變化

        2021-06-23 12:13:56常金梅張魯斌
        中國南方果樹 2021年3期

        常金梅,張魯斌

        (1 嶺南師范學(xué)院,廣東湛江,524091;2 嘉應(yīng)學(xué)院/廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東梅州,514000)

        菠蘿黑心病亦被稱為菠蘿內(nèi)部褐化病、小果心腐病、小果褐腐病等,是菠蘿主栽品種巴厘的主要采后病害之一[1],常在采后貯藏和運(yùn)輸過程中發(fā)生[2]。菠蘿黑心病發(fā)生時(shí)表現(xiàn)為果實(shí)外部無任何癥狀,橫剖后果心周圍果肉褐變,通常是小果基部或中部先出現(xiàn)半透明的水浸狀或淺褐色的小斑點(diǎn),隨著發(fā)病程度的加深,褐色斑點(diǎn)互相聯(lián)結(jié)成一片,并向果髓發(fā)展,最終果髓甚至果肉都變?yōu)楹诤稚瑢?dǎo)致果實(shí)品質(zhì)劣變,失去商品價(jià)值[3],嚴(yán)重影響菠蘿產(chǎn)業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易發(fā)展。該病害的生理機(jī)制尚不清楚。目前,國內(nèi)外尚無有效控制黑心病的方法,因此,黑心病作為菠蘿產(chǎn)業(yè)最普遍最重要的問題倍受關(guān)注[4-5]。

        酚類是植物抗病反應(yīng)的主要生化物質(zhì),也是果實(shí)發(fā)生褐變的主要底物之一,是一類苯環(huán)上含有1個(gè)或多個(gè)羥基的芳香族衍生物,能夠被逆境的生物和非生物因子誘導(dǎo)合成[6-7]。植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)代謝是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程[8]。菠蘿果實(shí)黑心病的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,其主要特征是褐變,本質(zhì)是鄰苯二酚、表兒茶酚、兒茶酚和綠原酸被多酚氧化酶氧化為醌類物質(zhì),繼而通過非酶促聚合生成黑色素而使組織變成褐色[9]。另有研究表明,果實(shí)酶促褐變起主要作用的酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等[10]。本研究主要針對(duì)采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中總酚含量變化及其代謝相關(guān)酶活性變化進(jìn)行系統(tǒng)研究,為明確菠蘿黑心病發(fā)生的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        “巴厘”Ananascomosus(L.) Merr. cv. Comte de Paris,感病品種;“無刺卡因”Ananascomosusr(L.) Merr. cv. Cayenne,抗病品種。

        1.2 方法

        1.2.1 材料處理及取樣方法 將田間采收的七八成成熟、大小均勻、無機(jī)械損傷的“巴厘”和“無刺卡因”果實(shí),保留頂芽,留果柄長1 cm,待田間熱散去,將菠蘿果實(shí)放入塑料框中,然后將塑料筐置于聚乙烯袋中,輕掩,常溫(25 ℃)貯藏,在果實(shí)黑心病發(fā)生過程中,及時(shí)拍照、取樣。

        取樣方法:“無刺卡因”取果實(shí)中部距離果心1 cm處的果肉,“巴厘”菠蘿病健部分開取樣,健康部位指赤道部位距果皮0.5 cm的果肉,發(fā)病部位指果梗與果肉交接處。每處理重復(fù) 3 次,每次隨機(jī)取果實(shí)10個(gè),將果肉切成小塊,液氮速凍,用高速粉碎機(jī)碾成粉末狀,做標(biāo)記后于-80 ℃保存。

        1.2.2 病情指數(shù)測(cè)定 果實(shí)黑心病分級(jí):0級(jí),無病斑;1級(jí),病斑面積占果實(shí)面積的5%以下;3級(jí),病斑面積占果實(shí)面積的6% ~25%;5級(jí),病斑面積占果實(shí)面積的26% ~50%;7級(jí),病斑面積占果實(shí)面積的50%以上。調(diào)查發(fā)病情況,計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)= ∑ (各級(jí)病果數(shù)×各級(jí)代表值) / (調(diào)查總果數(shù)×7)×100;

        1.2.3 總酚的測(cè)定 參考徐輝艷等[11]的方法略作改動(dòng),取樣品1 g,加入80 ℃蒸餾水10 mL,80 ℃水浴40 min,期間搖動(dòng)數(shù)次,取出冷卻后,過濾,定容至20 mL。以不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,取濾液1 mL,加入水5 mL,福林酚試劑1 mL, 10%Na2CO33 mL,放置2 h,于765 nm下測(cè)吸光度值,重復(fù)3次,單位mg/g。

        1.2.4 2,8-二羥甲基蒽醌的測(cè)定 參考金乾興等[12]的紫外分光光度法略作改動(dòng),取樣品1 g,加60%乙醇20 mL,80 ℃下超聲40 min,過濾,留濾液備用。以不同濃度的2,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后取濾液5 mL,用60%乙醇定容至10 mL,224 nm處測(cè)吸光度值,重復(fù)3次,單位mg/g。

        1.2.5 酚類代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定 PPO活性測(cè)定參考陳瑞琴等[13]的方法,POD、PAL、CAT活性測(cè)定參考劉曉陽等[14]的方法。

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

        數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件Microsoft Excel和SPSS 19.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan′s法進(jìn)行差異顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 黑心病的發(fā)生情況

        貯藏過程中,“巴厘”發(fā)生黑心病比較普遍,其黑心病在貯藏第4天開始零星發(fā)生;第6天時(shí),發(fā)病率達(dá)到80%,病斑較小,病情指數(shù)15.24,之后病斑快速擴(kuò)展;第10天時(shí),發(fā)病率達(dá)到了100%,病情指數(shù)70,果實(shí)完全失去了食用價(jià)值(見圖1);而“無刺卡因”在整個(gè)貯藏過程中均沒有發(fā)生黑心病。

        圖1 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”菠蘿果實(shí)黑心病發(fā)生情況

        2.2 總酚含量變化

        貯藏過程中,“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉總酚含量均無明顯的變化,“無刺卡因”果實(shí)總酚含量顯著高于“巴厘”?!鞍屠濉辈〔抗庵?,總酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì),從貯藏第4天開始總酚含量開始快速上升,到第6天達(dá)到高峰,為0.41 mg/g,是健康部位的1.43倍;且在第4、6、8天時(shí),其含量顯著高于“巴厘”健康部位,與黑心病發(fā)病時(shí)間相符(見圖2)。

        2.3 2,8-二羥甲基蒽醌含量變化

        “無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉中2,8-二羥甲基蒽醌含量沒有明顯波動(dòng),但“無刺卡因”中其含量顯著高于“巴厘”。在“巴厘”發(fā)病部位,2,8-二羥甲基蒽醌含量從第4天開始增加,且顯著高于健康部位,第8天時(shí)為健康部位的2.34倍,之后略有下降(見圖2)。

        圖2 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實(shí)總酚和2,8-二羥甲基蒽醌含量變化

        2.4 酚類代謝相關(guān)酶活性變化

        在貯藏過程中,0~8 d時(shí)“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PPO活性較穩(wěn)定,且“巴厘”的PPO活性顯著高于“無刺卡因”,第10天時(shí)”巴厘”健康部位PPO活性也出現(xiàn)升高?!鞍屠濉卑l(fā)病部位果肉PPO活性從第6天開始升高,第8天達(dá)到最高值,為55.86 0.01A/min·FW,為健康部位的2.12倍,之后一直維持在較高水平。

        在“無刺卡因”以及“巴厘”健康部位和發(fā)病部位,果肉過氧化物酶POD活性均呈下降趨勢(shì),“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉POD活性均無顯著性差異;從第6天開始,“巴厘”發(fā)病部位果肉POD活性顯著低于健康部位,第10天時(shí)POD活性下降了92.57 0.01A/min·FW,而健康部位只下降了45.94 0.01A/min·FW,下降速度差異顯著。

        整個(gè)貯藏過程中“無刺卡因”果肉CAT活性較低,最高只有1.18;“巴厘”菠蘿健康部位和發(fā)病部位果肉CAT活性均先上升后下降,但從第6天開始,發(fā)病部位果肉CAT活性顯著低于健康部位。

        “無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PAL活性均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì),且“無刺卡因”的PAL活性均顯著高于“巴厘”。“巴厘”發(fā)病部位PAL活性呈先上升后下降的趨勢(shì),在第4天時(shí)達(dá)到最高值,為25.83 0.01A/min·FW,之后快速下降;到第10天時(shí)僅為11.83 0.01A/min·FW,顯著低于健康部位(見圖3)。

        圖3 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實(shí)酚類代謝相關(guān)酶活性變化

        3 結(jié)論與討論

        酚類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì),酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物——醌的積累是植物對(duì)病原菌侵染和損傷的非?;苑磻?yīng)。反之,植物受到損傷時(shí),必然也在一定程度上影響到植物體內(nèi)原有的酚類代謝平衡[8]。本研究中,由于“巴厘”菠蘿在貯藏過程中黑心病發(fā)生比較普遍,因此分別取發(fā)病部位和健康部位做對(duì)比,并以抗黑心病的“無刺卡因”菠蘿作為對(duì)照進(jìn)行研究。菠蘿發(fā)病部位果肉總酚含量變化顯著,從第4天開始含量顯著提高,一直到第6天達(dá)到峰值,這也是菠蘿果肉褐化加劇的時(shí)期。有研究表明,酚類物質(zhì)是酶促反應(yīng)褐化的底物[15-16],因此酚類物質(zhì)含量的提高,使褐化底物增加,在相關(guān)酶的作用下被氧化為醌類物質(zhì),醌類物質(zhì)進(jìn)一步聚合成黑色素,從而發(fā)生黑心病。之后,隨著病情的進(jìn)一步加劇,總酚被逐步消耗,開始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

        酚類物質(zhì)酶促氧化是果實(shí)褐變的關(guān)鍵,PPO、POD 和 PAL是影響果實(shí)褐變的關(guān)鍵酶[17]。PPO使酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致果實(shí)褐變,POD是果實(shí)褐變的保護(hù)酶,但在H2O2存在時(shí)也可通過催化酚類物質(zhì)、類黃酮的氧化聚合導(dǎo)致果實(shí)褐變[18]。PAL是苯丙烷代謝途徑中酚類、植保素和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶,一般認(rèn)為PAL活性的增強(qiáng)對(duì)植物抗病是有利的。周玉嬋等研究認(rèn)為PPO是菠蘿黑心病致病的關(guān)鍵酶,低溫和GA3處理可提高PPO和PAL的活性并增加PPO底物的含量,使酶促氧化反應(yīng)更易進(jìn)行,導(dǎo)致黑心病的發(fā)生[19]。本研究中,隨著果實(shí)黑心病發(fā)生,病部PPO活性顯著增強(qiáng);“巴厘”健康部位和“無刺卡因”的果肉PPO活性則未出現(xiàn)明顯的變化,且前者一直高于后者,與“無刺卡因”一直沒有發(fā)生黑心病的現(xiàn)象相符,表明在菠蘿黑心病的發(fā)生過程中PPO發(fā)揮了重要的作用。對(duì)荔枝、冬瓜、龍眼、菊芋、中華壽桃等研究也表明PPO與酶促褐化有密切關(guān)系[20-24];陳瑞琴、劉保華等研究還表明了PPO是引起荔枝果皮酶促褐變最主要的酶之一,PPO活性越高褐化越嚴(yán)重[13]。本研究結(jié)果也支持PPO與菠蘿酶促褐化有密切聯(lián)系,PPO活性越高黑心病發(fā)生越嚴(yán)重。有研究報(bào)道,許多植物在遭受機(jī)械傷害、寒冷、微生物侵染等不良環(huán)境時(shí),植物體內(nèi)的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷類被激活,體內(nèi)PAL活性上升[25]。本研究結(jié)果顯示貯藏0~4 d時(shí),患病部位PAL活性升高,第6天時(shí)出現(xiàn)快速下降,顯著低于健康部位,POD活性也在第6天出現(xiàn)了顯著下降,顯著低于健康部位,由此可推測(cè)POD和PAL在菠蘿貯藏過程中對(duì)黑心病的發(fā)生起抑制作用。本研究主要進(jìn)行菠蘿黑心病發(fā)病過程中酚類物質(zhì)含量及其代謝相關(guān)酶活性變化的研究,今后可以進(jìn)行不同種類酚類組成和含量的測(cè)定與分析,深入探討褐變底物的差異對(duì)果實(shí)黑心病發(fā)生的影響。

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