常金梅，張魯斌

(1 嶺南師范學(xué)院，廣東湛江，524091；2 嘉應(yīng)學(xué)院/廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東梅州，514000)

菠蘿黑心病亦被稱為菠蘿內(nèi)部褐化病、小果心腐病、小果褐腐病等，是菠蘿主栽品種巴厘的主要采后病害之一[1]，常在采后貯藏和運(yùn)輸過程中發(fā)生[2]。菠蘿黑心病發(fā)生時(shí)表現(xiàn)為果實(shí)外部無任何癥狀，橫剖后果心周圍果肉褐變，通常是小果基部或中部先出現(xiàn)半透明的水浸狀或淺褐色的小斑點(diǎn)，隨著發(fā)病程度的加深，褐色斑點(diǎn)互相聯(lián)結(jié)成一片，并向果髓發(fā)展，最終果髓甚至果肉都變?yōu)楹诤稚瑢?dǎo)致果實(shí)品質(zhì)劣變，失去商品價(jià)值[3]，嚴(yán)重影響菠蘿產(chǎn)業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易發(fā)展。該病害的生理機(jī)制尚不清楚。目前，國內(nèi)外尚無有效控制黑心病的方法，因此，黑心病作為菠蘿產(chǎn)業(yè)最普遍最重要的問題倍受關(guān)注[4-5]。

酚類是植物抗病反應(yīng)的主要生化物質(zhì)，也是果實(shí)發(fā)生褐變的主要底物之一，是一類苯環(huán)上含有1個(gè)或多個(gè)羥基的芳香族衍生物，能夠被逆境的生物和非生物因子誘導(dǎo)合成[6-7]。植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)代謝是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程[8]。菠蘿果實(shí)黑心病的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，其主要特征是褐變，本質(zhì)是鄰苯二酚、表兒茶酚、兒茶酚和綠原酸被多酚氧化酶氧化為醌類物質(zhì)，繼而通過非酶促聚合生成黑色素而使組織變成褐色[9]。另有研究表明，果實(shí)酶促褐變起主要作用的酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等[10]。本研究主要針對(duì)采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中總酚含量變化及其代謝相關(guān)酶活性變化進(jìn)行系統(tǒng)研究，為明確菠蘿黑心病發(fā)生的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

“巴厘”Ananascomosus(L.) Merr. cv. Comte de Paris，感病品種；“無刺卡因”Ananascomosusr(L.) Merr. cv. Cayenne，抗病品種。

1.2 方法

1.2.1 材料處理及取樣方法 將田間采收的七八成成熟、大小均勻、無機(jī)械損傷的“巴厘”和“無刺卡因”果實(shí)，保留頂芽，留果柄長1 cm，待田間熱散去，將菠蘿果實(shí)放入塑料框中，然后將塑料筐置于聚乙烯袋中，輕掩，常溫(25 ℃)貯藏，在果實(shí)黑心病發(fā)生過程中，及時(shí)拍照、取樣。

取樣方法：“無刺卡因”取果實(shí)中部距離果心1 cm處的果肉，“巴厘”菠蘿病健部分開取樣，健康部位指赤道部位距果皮0.5 cm的果肉，發(fā)病部位指果梗與果肉交接處。每處理重復(fù) 3 次，每次隨機(jī)取果實(shí)10個(gè)，將果肉切成小塊，液氮速凍，用高速粉碎機(jī)碾成粉末狀，做標(biāo)記后于-80 ℃保存。

1.2.2 病情指數(shù)測(cè)定 果實(shí)黑心病分級(jí)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的5%以下；3級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的6% ～25%；5級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的26% ～50%；7級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的50%以上。調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)= ∑ (各級(jí)病果數(shù)×各級(jí)代表值) / (調(diào)查總果數(shù)×7)×100；

1.2.3 總酚的測(cè)定 參考徐輝艷等[11]的方法略作改動(dòng)，取樣品1 g，加入80 ℃蒸餾水10 mL，80 ℃水浴40 min，期間搖動(dòng)數(shù)次，取出冷卻后，過濾，定容至20 mL。以不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取濾液1 mL，加入水5 mL，福林酚試劑1 mL， 10%Na2CO33 mL，放置2 h，于765 nm下測(cè)吸光度值，重復(fù)3次，單位mg/g。

1.2.4 2，8-二羥甲基蒽醌的測(cè)定 參考金乾興等[12]的紫外分光光度法略作改動(dòng)，取樣品1 g，加60%乙醇20 mL，80 ℃下超聲40 min，過濾，留濾液備用。以不同濃度的2，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取濾液5 mL，用60%乙醇定容至10 mL，224 nm處測(cè)吸光度值，重復(fù)3次，單位mg/g。

1.2.5 酚類代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定 PPO活性測(cè)定參考陳瑞琴等[13]的方法，POD、PAL、CAT活性測(cè)定參考劉曉陽等[14]的方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件Microsoft Excel和SPSS 19.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan′s法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑心病的發(fā)生情況

貯藏過程中，“巴厘”發(fā)生黑心病比較普遍，其黑心病在貯藏第4天開始零星發(fā)生；第6天時(shí)，發(fā)病率達(dá)到80%，病斑較小，病情指數(shù)15.24，之后病斑快速擴(kuò)展；第10天時(shí)，發(fā)病率達(dá)到了100%，病情指數(shù)70，果實(shí)完全失去了食用價(jià)值(見圖1)；而“無刺卡因”在整個(gè)貯藏過程中均沒有發(fā)生黑心病。

圖1 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”菠蘿果實(shí)黑心病發(fā)生情況

2.2 總酚含量變化

貯藏過程中，“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉總酚含量均無明顯的變化，“無刺卡因”果實(shí)總酚含量顯著高于“巴厘”?！鞍屠濉辈〔抗庵?，總酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，從貯藏第4天開始總酚含量開始快速上升，到第6天達(dá)到高峰，為0.41 mg/g，是健康部位的1.43倍；且在第4、6、8天時(shí)，其含量顯著高于“巴厘”健康部位，與黑心病發(fā)病時(shí)間相符(見圖2)。

2.3 2，8-二羥甲基蒽醌含量變化

“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉中2，8-二羥甲基蒽醌含量沒有明顯波動(dòng)，但“無刺卡因”中其含量顯著高于“巴厘”。在“巴厘”發(fā)病部位，2，8-二羥甲基蒽醌含量從第4天開始增加，且顯著高于健康部位，第8天時(shí)為健康部位的2.34倍，之后略有下降(見圖2)。

圖2 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實(shí)總酚和2，8-二羥甲基蒽醌含量變化

2.4 酚類代謝相關(guān)酶活性變化

在貯藏過程中，0～8 d時(shí)“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PPO活性較穩(wěn)定，且“巴厘”的PPO活性顯著高于“無刺卡因”，第10天時(shí)”巴厘”健康部位PPO活性也出現(xiàn)升高?！鞍屠濉卑l(fā)病部位果肉PPO活性從第6天開始升高，第8天達(dá)到最高值，為55.86 0.01A/min·FW，為健康部位的2.12倍，之后一直維持在較高水平。

在“無刺卡因”以及“巴厘”健康部位和發(fā)病部位，果肉過氧化物酶POD活性均呈下降趨勢(shì)，“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉POD活性均無顯著性差異；從第6天開始，“巴厘”發(fā)病部位果肉POD活性顯著低于健康部位，第10天時(shí)POD活性下降了92.57 0.01A/min·FW，而健康部位只下降了45.94 0.01A/min·FW，下降速度差異顯著。

整個(gè)貯藏過程中“無刺卡因”果肉CAT活性較低，最高只有1.18；“巴厘”菠蘿健康部位和發(fā)病部位果肉CAT活性均先上升后下降，但從第6天開始，發(fā)病部位果肉CAT活性顯著低于健康部位。

“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PAL活性均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，且“無刺卡因”的PAL活性均顯著高于“巴厘”。“巴厘”發(fā)病部位PAL活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第4天時(shí)達(dá)到最高值，為25.83 0.01A/min·FW，之后快速下降；到第10天時(shí)僅為11.83 0.01A/min·FW，顯著低于健康部位(見圖3)。

圖3 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實(shí)酚類代謝相關(guān)酶活性變化

3 結(jié)論與討論

酚類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物——醌的積累是植物對(duì)病原菌侵染和損傷的非?；苑磻?yīng)。反之，植物受到損傷時(shí)，必然也在一定程度上影響到植物體內(nèi)原有的酚類代謝平衡[8]。本研究中，由于“巴厘”菠蘿在貯藏過程中黑心病發(fā)生比較普遍，因此分別取發(fā)病部位和健康部位做對(duì)比，并以抗黑心病的“無刺卡因”菠蘿作為對(duì)照進(jìn)行研究。菠蘿發(fā)病部位果肉總酚含量變化顯著，從第4天開始含量顯著提高，一直到第6天達(dá)到峰值，這也是菠蘿果肉褐化加劇的時(shí)期。有研究表明，酚類物質(zhì)是酶促反應(yīng)褐化的底物[15-16]，因此酚類物質(zhì)含量的提高，使褐化底物增加，在相關(guān)酶的作用下被氧化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進(jìn)一步聚合成黑色素，從而發(fā)生黑心病。之后，隨著病情的進(jìn)一步加劇，總酚被逐步消耗，開始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

酚類物質(zhì)酶促氧化是果實(shí)褐變的關(guān)鍵，PPO、POD 和 PAL是影響果實(shí)褐變的關(guān)鍵酶[17]。PPO使酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致果實(shí)褐變，POD是果實(shí)褐變的保護(hù)酶，但在H2O2存在時(shí)也可通過催化酚類物質(zhì)、類黃酮的氧化聚合導(dǎo)致果實(shí)褐變[18]。PAL是苯丙烷代謝途徑中酚類、植保素和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，一般認(rèn)為PAL活性的增強(qiáng)對(duì)植物抗病是有利的。周玉嬋等研究認(rèn)為PPO是菠蘿黑心病致病的關(guān)鍵酶，低溫和GA3處理可提高PPO和PAL的活性并增加PPO底物的含量，使酶促氧化反應(yīng)更易進(jìn)行，導(dǎo)致黑心病的發(fā)生[19]。本研究中，隨著果實(shí)黑心病發(fā)生，病部PPO活性顯著增強(qiáng)；“巴厘”健康部位和“無刺卡因”的果肉PPO活性則未出現(xiàn)明顯的變化，且前者一直高于后者，與“無刺卡因”一直沒有發(fā)生黑心病的現(xiàn)象相符，表明在菠蘿黑心病的發(fā)生過程中PPO發(fā)揮了重要的作用。對(duì)荔枝、冬瓜、龍眼、菊芋、中華壽桃等研究也表明PPO與酶促褐化有密切關(guān)系[20-24]；陳瑞琴、劉保華等研究還表明了PPO是引起荔枝果皮酶促褐變最主要的酶之一，PPO活性越高褐化越嚴(yán)重[13]。本研究結(jié)果也支持PPO與菠蘿酶促褐化有密切聯(lián)系，PPO活性越高黑心病發(fā)生越嚴(yán)重。有研究報(bào)道，許多植物在遭受機(jī)械傷害、寒冷、微生物侵染等不良環(huán)境時(shí)，植物體內(nèi)的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷類被激活，體內(nèi)PAL活性上升[25]。本研究結(jié)果顯示貯藏0～4 d時(shí)，患病部位PAL活性升高，第6天時(shí)出現(xiàn)快速下降，顯著低于健康部位，POD活性也在第6天出現(xiàn)了顯著下降，顯著低于健康部位，由此可推測(cè)POD和PAL在菠蘿貯藏過程中對(duì)黑心病的發(fā)生起抑制作用。本研究主要進(jìn)行菠蘿黑心病發(fā)病過程中酚類物質(zhì)含量及其代謝相關(guān)酶活性變化的研究，今后可以進(jìn)行不同種類酚類組成和含量的測(cè)定與分析，深入探討褐變底物的差異對(duì)果實(shí)黑心病發(fā)生的影響。