王雨亭，萬(wàn)水林，閆承璞，胡鐘東，湯雨晴

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南昌，330200)

新余蜜桔是江西省繼南豐蜜桔和贛南臍橙之后又一極具特色的地方果樹(shù)優(yōu)良品種，其果實(shí)外觀鮮艷，果實(shí)味甜，果肉細(xì)嫩且化渣性好，但果實(shí)有籽成為其發(fā)展的最大障礙之一[1]。一般情況下，三倍體果實(shí)具有無(wú)核或少核的特征，且抗性強(qiáng)，因此獲得三倍體是柑桔無(wú)核育種的重要途徑之一。目前培育三倍體最經(jīng)典、最有效的育種途徑是以單胚性二倍體品種為母本與四倍體材料進(jìn)行雜交，同時(shí)結(jié)合胚搶救獲得三倍體植株[2]。與較容易獲得的二倍體相比較，四倍體資源對(duì)于無(wú)核育種更為迫切。

很多學(xué)者對(duì)四倍體亦開(kāi)展了較多研究。如：沙田柚與宜昌橙異源四倍體植株的葉片顏色比二倍體明顯更深、葉片更厚，花器官也變大[3]。劉慶忠等[4]通過(guò)切片觀察發(fā)現(xiàn)，皇家嘎啦蘋(píng)果同源四倍體葉片的柵欄組織和海綿組織厚度均比二倍體顯著增加。Allario等[5]在檸檬同源四倍體葉片中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。Beaulieu等[6]發(fā)現(xiàn)被子植物基因組的大小與保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度及表皮細(xì)胞面積呈顯著正相關(guān)，與氣孔密度呈顯著負(fù)相關(guān)，認(rèn)為多倍體通過(guò)提高細(xì)胞核DNA含量，增大細(xì)胞體積，可獲得更大的營(yíng)養(yǎng)器官。Tan等[7]比較研究了資陽(yáng)香橙(CitrusjunosSieb. ex Tanaka)雙二倍體和二倍體葉片在初生及次生代謝物方面的差異，發(fā)現(xiàn)雙二倍體葉片中與脅迫相關(guān)的初生代謝物和基因均顯著上調(diào)，而黃酮類(lèi)等次生代謝物和相關(guān)基因均被抑制。譚豐全等[8]基于代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，相比“鄂柑1號(hào)”(CitrusreticulataBlanco)二倍體親本，其雙二倍體通過(guò)抑制成熟后期檸檬酸的降解和利用，促使其果實(shí)積累了更多的檸檬酸。可見(jiàn)，植物染色體加倍后，通常會(huì)引起生物學(xué)性狀、代謝物及基因表達(dá)等多方面發(fā)生變化。

隨著細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展，世界范圍內(nèi)獲得了大量的異源四倍體細(xì)胞雜種，且已經(jīng)被用于無(wú)核育種中。Grosser等[9]利用柑桔異源四倍體體細(xì)胞與二倍體雜交獲得了12 000株三倍體。解凱東等[10,11]經(jīng)過(guò)多年研究，利用創(chuàng)制的柑桔四倍體體細(xì)胞雜種，與二倍體雜交累計(jì)獲得三倍體株系1 156株，這些三倍體還在進(jìn)一步研究中。同時(shí)，倍性育種培育的三倍體會(huì)因?yàn)橛H本選擇不同而表現(xiàn)出不同的性狀。如：以“Sugar Belle”為母本獲得的三倍體表現(xiàn)出結(jié)果早、枝刺短等優(yōu)良性狀，而以單胚的“克里曼丁桔”為母本獲得的三倍體后代表現(xiàn)出結(jié)果晚、枝刺長(zhǎng)等特點(diǎn)[9]?？梢?jiàn)，雜交親本的選擇直接影響了后代農(nóng)藝性狀的優(yōu)劣。因此，為了提高育種效率，有必要對(duì)獲得的四倍體材料進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，并明確其優(yōu)良農(nóng)藝性狀，以期更好地將其應(yīng)用于無(wú)核育種中。

筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)了一株自然變異的新余蜜桔四倍體(4x)材料，且已進(jìn)入結(jié)果期，觀察分析其生物學(xué)特性及農(nóng)藝性狀，對(duì)于培育新余蜜桔無(wú)核品種，創(chuàng)制柑桔新型種質(zhì)，具有至關(guān)重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料筆者2015年在本單位試驗(yàn)基地7年生新余蜜桔園內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)自然變異的單株，隨機(jī)取該植株上的葉片，經(jīng)流式細(xì)胞儀(Partec CyFlowspace, Germany)檢測(cè)，證實(shí)該植株為四倍體，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，以下將該植株命名為“新余蜜桔自然4x”。2016年從該植株上采集接穗高位嫁接于新余蜜桔二倍體(2x)植株上。本試驗(yàn)所取葉片均為高位嫁接的新余蜜桔自然4x葉片及該植株上相同方位的2x葉片。每個(gè)植株取當(dāng)年生營(yíng)養(yǎng)春梢頂端以下第4—6片葉(取樣日期為2019年5月31日)，每3個(gè)枝條為1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)[8]。新余蜜桔自然4x和2x葉片樣品及田間枝梢的比較見(jiàn)圖2。

圖1 新余蜜桔二倍體(2x)與自然四倍體(4x)混合葉片樣品流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)結(jié)果

注：葉片樣品于2019年5月31日采集；黑色框內(nèi)為高接新余蜜桔自然4x枝梢，其余為2x枝梢。

1.2 葉片形態(tài)學(xué)特征測(cè)定與觀察每種材料取10片葉，用電子千分尺測(cè)定葉片長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算葉形指數(shù)，同時(shí)測(cè)定葉片厚度。

石蠟切片取樣選擇葉片中間部位主葉脈一側(cè)且避開(kāi)側(cè)葉脈處。用FAA固定液(福爾馬林5 mL + 乙酸5 mL + 70%乙醇90 mL)固定樣品1周，脫水，透明后石蠟包埋，切片，脫蠟，復(fù)水等。本研究采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

利用掃描電鏡觀察葉片氣孔形態(tài)[12]。樣品在流動(dòng)水下沖干凈，吸干水分后置于4%戊二醛溶液固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗，4 ℃過(guò)夜，無(wú)水乙醇梯度脫水30 min，臨界點(diǎn)干燥，鍍金等，最后于日立SU8010掃描電鏡(加速電壓5 kV)下觀察。

1.3 相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定葉綠素含量，光合作用關(guān)鍵酶二磷酸核酮糖羧化酶(加氧酶，Rubisco)及丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)活性，總酚、木質(zhì)素及脯氨酸含量的測(cè)定，均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒。葉綠素用80%丙酮溶解，提取，在波長(zhǎng)665和649 nm下測(cè)定吸光度。Rubisco活性通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)340 nm下還原型輔酶I(NADH)的氧化速率來(lái)反應(yīng)，PPDK活性通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)340 nm下還原型輔酶I的減少率來(lái)計(jì)算。酚類(lèi)物質(zhì)與鎢鉬酸發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生的藍(lán)色化合物在760 nm處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值計(jì)算總酚含量。木質(zhì)素中的酚羥基發(fā)生乙?；笤?80 nm處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值計(jì)算木質(zhì)素含量。利用磺基水楊酸提取脯氨酸，脯氨酸與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，加甲苯萃取后，在520 nm處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值計(jì)算脯氨酸含量。

1.4 葉片內(nèi)源激素含量測(cè)定選取新余蜜桔自然4x和2x葉片材料(2019年5月31日取樣)，每株同一方位采集春梢下第4—5片葉，制備混合樣。樣品用研磨儀(MM 400，Retsch)研磨至粉末狀，稱(chēng)取50 mg樣本，用甲醇∶水∶甲酸 = 15∶4∶1(體積比)進(jìn)行提取，復(fù)溶，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)儀進(jìn)行分析。液相色譜條件主要包括：色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：超純水，乙腈(加入0.05%的甲酸)。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓4 500 V，簾氣(curtain gas，CUR)241.325 kPa(35 psi)，碰撞誘導(dǎo)電離 (collision-activated dissociation，CAD)參數(shù)設(shè)置為medium。

1.5 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)結(jié)果均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及做圖，采用T檢驗(yàn)分析4x和2x之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片形態(tài)特征新余蜜桔自然4x與2x葉片均成卵圓形。相比新余蜜桔2x，新余蜜桔自然4x葉片葉形指數(shù)顯著降低，且厚度顯著增加，其中，葉形指數(shù)降低52.47%，葉片厚度增加33.42%(見(jiàn)表1)。新余蜜桔自然4x的葉片顯得更寬大，更厚重。

表1 新余蜜桔自然4x與2x葉形指數(shù)和葉片厚度對(duì)比

2.2 葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，新余蜜桔自然4x葉片的細(xì)胞顯著大于新余蜜桔2x(圖3)。掃描電鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，新余蜜桔自然4x葉片氣孔器密度減小，但氣孔開(kāi)口變大(圖4)。

圖4 新余蜜桔自然4x與2x葉片氣孔器形態(tài)比較(掃描電鏡)

2.3 葉片主要生理生化特征新余蜜桔自然4x葉片的全碳和全氮含量與2x無(wú)顯著性差異，葉片蛋白質(zhì)總含量顯著高于2x，此外，葉綠素a、葉綠素b含量及葉綠素總含量分別比2x高8.4%、55.3%和54.6%；但是，光合作用2個(gè)關(guān)鍵酶Rubisco和 PPDK的活性與2x相比顯著降低，分別降低28.3%及22.35%。與2x相比，新余蜜桔自然4x葉片的木質(zhì)素及總酚含量分別顯著高出23.0%和12.6%，表現(xiàn)出較高的抗逆性潛能，而脯氨酸含量差異不顯著(見(jiàn)表2)。

表2 新余蜜桔自然4x與2x葉片主要生理生化特征對(duì)比

注：石蠟切片，放大100倍觀察。

2.4 葉片內(nèi)源激素試驗(yàn)檢測(cè)了5大類(lèi)24種內(nèi)源激素，其中15種激素低于檢測(cè)閾值，其余9種激素在葉片中的含量如表3所示。新余蜜桔自然4x葉片內(nèi)源吲哚乙酸(IAA)及異戊烯基腺嘌呤(IP)含量均高于2x葉片，這兩種激素均與植物細(xì)胞分裂有關(guān)，而且IP參與植物葉綠素的合成。此外，新余蜜桔自然4x葉片內(nèi)源脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)含量也顯著高于2x葉片，而這兩種激素均與植物抗逆性密切相關(guān)。

表3 新余蜜桔4x與2x葉片部分內(nèi)源激素含量(以鮮質(zhì)量計(jì)) ng/g

3 討論

葉片組織結(jié)構(gòu)在一定程度上能夠反映植物的生理適應(yīng)性，可將植物葉片組織結(jié)構(gòu)作為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、育種和抗逆性研究的重要依據(jù)[13]。

3.1 多倍體組織形態(tài)學(xué)特征一般情況下，多倍體植株普遍比二倍體擁有更大的器官。如：沙田柚與宜昌橙的異源四倍體比二倍體的葉片更厚，而且花器官更大[3]；檸檬同源四倍體葉片的柵欄組織和海綿組織變大，葉片變大，且葉片含水量增加[5]；資陽(yáng)香橙四倍體的葉片比二倍體大且厚，同時(shí)葉片氣孔變大，但氣孔密度變低[6]；多倍體枇杷的葉片相比二倍體也表現(xiàn)出更寬、更厚的特征[14]；擬南芥同源四倍體與二倍體的成熟胚和子葉的細(xì)胞數(shù)目無(wú)差異，但四倍體的細(xì)胞顯著增大[15]。本試驗(yàn)中，新余蜜桔自然4x葉片與2x相比表現(xiàn)出更寬、更厚的特征，同時(shí)葉肉細(xì)胞變大，與前人研究結(jié)果較為一致。由此推測(cè)，新余蜜桔自然4x葉片變大的原因可能是葉肉細(xì)胞變大所致。

此外，有研究在轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)現(xiàn)，隨著內(nèi)源激素IAA水平升高，煙草葉片氣孔密度減小，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度增加，柵欄組織細(xì)胞增大，同時(shí)葉片厚度增加[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，新余蜜桔自然4x葉片除了變寬變厚、氣孔變大之外，其內(nèi)源IAA及IP含量顯著高于2x。由此推測(cè)，新余蜜桔自然4x葉片可能通過(guò)增加內(nèi)源激素IAA及IP的合成代謝刺激葉肉細(xì)胞增大，從而引起葉片變厚，葉形指數(shù)變小。

3.2 多倍體光合作用特征葉綠素含量高低直接影響植物的光合效率。很多研究表明，植物葉片葉綠素含量與倍性關(guān)系密切。如：四倍體葡萄葉片的葉綠素含量顯著高于二倍體葉片[17]，枇杷三倍體和四倍體葉片的葉綠素含量均高于二倍體[14]，而白菜多倍體葉片葉綠體含量與二倍體的差異不顯著[18-19]。本試驗(yàn)中出現(xiàn)了類(lèi)似情況，與新余蜜桔2x葉片相比，新余蜜桔自然4x葉片的葉綠素含量顯著升高。但是，本試驗(yàn)測(cè)定的2個(gè)光合作用關(guān)鍵酶Rubisco及PPDK的活性，新余蜜桔自然4x相比新余蜜桔2x有所降低。新余蜜桔自然4x與2x葉片光合作用的差異及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.3 多倍體抗逆性特征果樹(shù)多倍體是重要的抗逆種質(zhì)資源，普遍具有良好的抗逆性，對(duì)環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)性。如：蘋(píng)果同源四倍體在應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫時(shí)，表現(xiàn)出比二倍體更強(qiáng)的耐脅迫能力[20-21]；兩個(gè)蘋(píng)果品種“富寒”和“Gala”的同源四倍體和二倍體在鹽脅迫處理后，四倍體表現(xiàn)出更強(qiáng)的鹽脅迫適應(yīng)能力[22]，并且該耐鹽脅迫品種的四倍體還表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱能力[21]；四倍體來(lái)檬在抗旱方面顯著優(yōu)于其二倍體，究其原因，四倍體來(lái)檬根系合成ABA的能力增強(qiáng)[5]。研究表明，多倍體植物可以通過(guò)調(diào)整細(xì)胞內(nèi)源激素等變化增強(qiáng)其抗逆性[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新余蜜桔自然4x葉片中與植物抗性密切相關(guān)的總酚和木質(zhì)素含量，與抗旱性相關(guān)的激素ABA含量，與抵抗病原菌侵染密切相關(guān)的激素JA含量等均顯著高于2x，理論上該自然四倍體具有良好的抗性。近年來(lái)當(dāng)?shù)匚从心婢匙匀粭l件出現(xiàn)，該自然4x的抗逆性未能得到印證，但從長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，新余蜜桔自然4x的長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng)、更旺。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展新余蜜桔自然4x的抗逆性試驗(yàn)，充分挖掘和掌握該資源的性狀特點(diǎn)，為今后開(kāi)展有針對(duì)性的倍性育種探明方向。此外，新余蜜桔自然4x葉片中與抗逆相關(guān)的其他初生及次生代謝物和基因表達(dá)是否也發(fā)生相應(yīng)變化，還有待深入研究[7]。

綜上所述，新余蜜桔自然4x可能具有更強(qiáng)的光合作用和抗逆性，可以為新余蜜桔和其他柑桔品種的無(wú)核選育提供良好的親本材料及理論參考。