劉福平，王 茜，陳東奎，廖惠紅，黃宏明，張堯良，黃其椿，汪妮娜，張 蘭，董伯年，何東模，施平麗

(1 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣西柑桔黃龍病防控工程技術(shù)研究中心，南寧，530007；2 廣西壯族自治區(qū)容縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西容縣，537500)

沙田柚是我國(guó)柚類優(yōu)良品種之一[1]，果大形美，風(fēng)味佳，耐貯藏[2]，在廣西、廣東、湖南、四川、浙江和江西均有種植[3]，以容縣沙田柚和梅州金柚最為有名。容縣是沙田柚原產(chǎn)地，被稱為“中國(guó)沙田柚之鄉(xiāng)”，容縣沙田柚也是地理標(biāo)志產(chǎn)品[4]。截至2019年，容縣沙田柚種植面積達(dá)1.4 萬(wàn)hm2(21萬(wàn)畝)，產(chǎn)量達(dá)22萬(wàn)t，全縣15個(gè)鎮(zhèn)都有種植。近年來(lái)，柑桔黃龍病已成為影響沙田柚品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素之一[5]。感染柑桔黃龍病后，沙田柚會(huì)出現(xiàn)“黃梢”和斑駁黃化葉，病葉容易脫落，病果變小、畸形、著色不均勻[6]，隨著發(fā)病程度加深，果實(shí)品質(zhì)下降，酸度和異味度顯著提高，失去食用價(jià)值，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到嚴(yán)重影響[7]。目前柑桔黃龍病依然無(wú)有效防治藥劑，有效防控措施是清除病源和切斷傳播媒介。因此，探究快速、髙效、便攜、適合大規(guī)模使用的田間診斷技術(shù)，對(duì)柑桔黃龍病的流行預(yù)警和及時(shí)防控具有重要的生產(chǎn)意義[8]?；诮t外技術(shù)的柑桔黃龍病田間快速檢測(cè)方法，具有快速、安全、無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)[9]。前人針對(duì)沙糖桔、臍橙、沃柑、溫州蜜柑等品種，采集葉片近紅外光譜，建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)模型并驗(yàn)證，證明了利用近紅外光譜檢測(cè)柑桔黃龍病的可行性[8,10-12]。廣州訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)有限公司開發(fā)了手持近紅外光譜檢測(cè)儀，使用其已建立好的沙糖桔黃龍病識(shí)別模型對(duì)沙田柚黃龍病疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果以Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果為參照，準(zhǔn)確率低于該模型自身識(shí)別率。推測(cè)是由不同品種柑桔葉片的近紅外光譜存在差異所致[8]。

筆者從容縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集沙田柚樣品，以Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果為參照，采用手持式近紅外光譜儀開展沙田柚黃龍病的檢測(cè)研究，旨在探索沙田柚黃龍病簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的田間快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙田柚樣品采自容縣容州鎮(zhèn)、自良鎮(zhèn)、縣底鎮(zhèn)、十里鎮(zhèn)、六王鎮(zhèn)、浪水鎮(zhèn)、松山鎮(zhèn)、石寨鎮(zhèn)等果園。采樣時(shí)間分兩批，第一批采樣時(shí)間為2019年2月，第二批采樣時(shí)間為2019年11月。樣品類型包括無(wú)癥狀葉、斑駁黃化葉、均勻黃化葉(主要為黃梢黃化葉)、缺素黃化葉(主要為缺鎂)、其他黃化葉(主要為爛根、損傷導(dǎo)致的黃化葉)，共305株樹，590份樣品。

1.2 儀器設(shè)備

光譜儀器使用廣州訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)有限公司開發(fā)的手持近紅外光譜檢測(cè)儀，采用NGD-HL11模塊，該模塊采用最新的MEMS微鏡技術(shù)原理，波長(zhǎng)范圍950～1 650 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 采集不同果園的葉片樣品。按照果園、樹、癥狀進(jìn)行分區(qū)、編號(hào)和分類，采集的葉片樣品要求有代表性。一株樹從不同方位采集癥狀一致的5張葉片歸為一個(gè)樣品。

1.3.2 樣品處理與保存 清洗并擦干樣品葉片，使其干凈、無(wú)污漬，4 ℃冷藏暫存，采集完光譜的樣品轉(zhuǎn)入-40 ℃低溫冰箱保存。

1.3.3 光譜采集 每片葉采集基部、中部、尾部主葉脈附近3個(gè)點(diǎn)，避開支葉脈位置，5片葉共采集15條光譜。

1.3.4 樣品Nested-PCR檢測(cè) 取葉片主葉脈每份100 mg，用液氮研磨至粉末狀，放-20 ℃保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)提取DNA[13]，采用黃龍病亞洲種16S rDNA特異引物fD1/fD2和OI1/OI2進(jìn)行Nested-PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后拍照[14]。

1.3.5 建模及驗(yàn)證 采用2019年11月收集的307份樣品，共4 593條近紅外光譜(因剔除了明顯錯(cuò)誤的光譜，故實(shí)際利用光譜數(shù)少于原采集光譜數(shù)，下同)，以黃龍病亞洲種Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果為參照，利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量分布(SNV)預(yù)處理[10]，在一定程度上減少溫度、水分等因素對(duì)葉片光譜的干擾，然后采取偏最小二乘法識(shí)別分析(PLS-DA)[12]，將樣品劃分為建模集和檢驗(yàn)樣品集，建模集用于確定近紅外定量模型的參數(shù)，然后采用不參與建模過(guò)程的檢驗(yàn)樣品集對(duì)優(yōu)選的模型進(jìn)行檢驗(yàn)[10]。根據(jù)模型的可用性來(lái)評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)未知樣品的能力，本研究采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)為識(shí)別率。識(shí)別率(%)=(預(yù)測(cè)準(zhǔn)確的近紅外光譜數(shù)/總近紅外光譜數(shù))×100。

1.3.6 不同時(shí)間樣品驗(yàn)證 采用2019年2月283份樣品的4 147條近紅外光譜作為驗(yàn)證集，以Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果為參照，進(jìn)行模型驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集情況

采集的樣品分別來(lái)自輕度感病(柑桔黃龍病)、中度感病、重度感病的沙田柚樹以及未感病但有其他黃化癥狀的沙田柚樹。秋季，輕度感病沙田柚樹，一般在樹的中上部出現(xiàn)一枝到多枝黃梢，黃梢基部葉片出現(xiàn)斑駁黃化，大部分果實(shí)大小、形狀與正常果無(wú)差異，水分較少，品嘗后先甜后苦，或出現(xiàn)個(gè)別畸形小果，小果的結(jié)果枝葉片黃化，但不表現(xiàn)斑駁癥狀。中度感病沙田柚樹，部分大枝會(huì)表現(xiàn)癥狀，老葉斑駁黃化，表現(xiàn)癥狀的大枝長(zhǎng)勢(shì)明顯衰退，果實(shí)變小，水分變少，入口即有苦味，回酸，但其他未表現(xiàn)癥狀的大枝，果實(shí)大小與正常果差異較小，略有苦味。重度感病沙田柚樹，整株樹嚴(yán)重衰退，大部分老葉明顯斑駁，葉片變小、變脆，易脫落，果實(shí)全部變小，有酸味和異味，失去食用價(jià)值。春季，由于樹體恢復(fù)生長(zhǎng)，感染黃龍病的樹整體會(huì)返綠，葉片斑駁癥狀較不明顯，但是中度感病和重度感病的沙田柚花苞多，多出現(xiàn)畸形花，新梢少，老葉葉片較少，易脫落。其他采樣沙田柚樹包括表現(xiàn)為缺素(主要為缺鎂)的黃化樹和爛根、損傷造成的黃化樹。

2.2 近紅外光譜建模情況

2019年11月采集的307份樣品近紅外光譜建立的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)模型總識(shí)別率81.75%，陽(yáng)性樣品識(shí)別率83.41%，陰性樣品識(shí)別率78.80%，假陽(yáng)性率7.62%，假陰性率10.62%(見表1)。其中，不同癥狀樣品總識(shí)別率從高到低依次為斑駁黃化葉96.72%>缺素黃化葉79.67%>無(wú)癥狀葉71.57%>均勻黃化葉65.06%>其他黃化葉53.64%；均勻黃化葉和其他黃化葉陰性樣品識(shí)別率較低，分別為45.03%和41.38%，即均勻黃化葉陰性樣品有54.97%、其他黃化葉陰性樣品有58.62%被近紅外光譜檢測(cè)識(shí)別為陽(yáng)性，是造成結(jié)果假陽(yáng)性的主要原因；無(wú)癥狀葉和缺素黃化葉陽(yáng)性樣品識(shí)別率較低，分別為36.01%和40.00%，即無(wú)癥狀葉陽(yáng)性樣品有63.99%、缺素黃化葉陽(yáng)性樣品有60.00%被近紅外光譜檢測(cè)識(shí)別為陰性，是造成結(jié)果假陰性的主要原因；均勻黃化葉和其他黃化葉總識(shí)別率較低，進(jìn)而降低了整個(gè)模型的總識(shí)別率。

表1 柑桔黃龍病手持式近紅外光譜儀模型對(duì)秋季不同葉片樣品的識(shí)別率

2.3 不同時(shí)期樣品驗(yàn)證情況

利用11月樣品建成的模型去驗(yàn)證2月采集光譜樣品，總識(shí)別率64.58%，陽(yáng)性樣品識(shí)別率61.22%，陰性樣品識(shí)別率67.09%，假陽(yáng)性率18.83%，假陰性率16.59%(見表2)。與11月樣品建成模型自身相比，總識(shí)別率、陽(yáng)性樣品識(shí)別率、陰性樣品識(shí)別率均降低，而假陽(yáng)性率、假陰性率卻上升；無(wú)癥狀葉假陰性率提高16.06個(gè)百分點(diǎn)，斑駁黃化葉假陰性率提高7.1個(gè)百分點(diǎn)，是致使陽(yáng)性樣品識(shí)別率降低的主要原因；其他黃化葉假陽(yáng)性率提高14.38個(gè)百分點(diǎn)，是致使陰性樣品識(shí)別率降低的主要原因。

表2 柑桔黃龍病手持式近紅外光譜儀模型對(duì)春季不同葉片樣品的識(shí)別率

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，11月經(jīng)Nested-PCR檢測(cè)為柑桔黃龍病陽(yáng)性的無(wú)癥狀葉樣品和缺素黃化葉樣品，分別有63.99%和60.00%被近紅

外光譜檢測(cè)識(shí)別為陰性，分析原因是這部分無(wú)癥狀葉帶菌量低，對(duì)葉片近紅外光譜影響極小，接近正常葉近紅外光譜；其他黃化葉、均勻黃化葉經(jīng)Nested-PCR檢測(cè)為陰性的樣品，分別有58.62%、54.96%被近紅外光譜檢測(cè)識(shí)別為陽(yáng)性，分析原因這部分葉片癥狀可能是爛根、樹體損傷等原因所致，其黃化癥狀接近黃龍病菌引起的黃化，近紅外光譜相似。因此，帶菌的無(wú)癥狀葉會(huì)造成近紅外光譜檢測(cè)結(jié)果假陰性，而爛根、損傷導(dǎo)致的其他黃化葉和均勻黃化葉則會(huì)造成近紅外光譜檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性，是致使近紅外光譜模型識(shí)別準(zhǔn)確率降低的重要原因，這與王娟等[15]的研究結(jié)果相符。近紅外光譜檢測(cè)無(wú)損、快速，但在對(duì)無(wú)癥狀葉、缺素黃化葉、均勻黃化葉、其他黃化葉(爛根、樹體損傷所致)檢測(cè)中靈敏度有待提高。

11月樣品建立的模型在用2月樣品進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，總識(shí)別率降低，其中陽(yáng)性樣品識(shí)別率下降較多，達(dá)22.19個(gè)百分點(diǎn)。分析原因是樣品本身近紅外光譜存在差異，沙田柚感染黃龍病后表現(xiàn)癥狀到11月時(shí)最明顯，在2月時(shí)相對(duì)較輕，且2月是樹體恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)期，葉片相對(duì)秋冬季會(huì)返綠，水分增加，光澤度變高，與未感染黃龍病葉片癥狀差異減小，同時(shí)，不同時(shí)間采集近紅外光譜時(shí)外界環(huán)境因素存在差異。因此，不同時(shí)期黃龍病葉片癥狀不同會(huì)導(dǎo)致近紅外光譜差異，黃龍病葉片秋冬季癥狀表現(xiàn)最明顯，與未感染黃龍病葉片特征差異最大，含水量偏低[16]，此時(shí)近紅外光譜差異也最大，檢測(cè)準(zhǔn)確率較高。近紅外光譜檢測(cè)儀采集葉片光譜時(shí)要求較高，會(huì)受到外界測(cè)量條件光強(qiáng)、水分、灰塵等的干擾[16]，模型在檢測(cè)使用時(shí)間、環(huán)境上有局限性。

在王娟等[15]開展的手持式近紅外光譜儀識(shí)別沙糖桔黃龍病研究中，黃龍病檢測(cè)綜合符合率為78.6%，其中陽(yáng)性符合率為73.6%，假陽(yáng)性率為10.7%，陰性符合率為82.5%，假陰性率為10.0%。這與本研究建立的沙田柚標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)模型基本一致，識(shí)別率均不算高，離田間使用要求還存在差距。在今后黃龍病近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)研究中，應(yīng)盡量減少不同時(shí)間樣品癥狀、環(huán)境對(duì)其光譜的影響，同時(shí)提高其對(duì)帶菌的無(wú)癥狀葉、缺素黃化葉和不帶菌的均勻黃化葉和其他黃化葉等的檢測(cè)靈敏度，以進(jìn)一步提高其識(shí)別率。