林艷麗 覃建兵 伍翔 王巖巖 潘佑找 柳忠玉

（1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院 荊州 434025）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）是蓼科多年生藥用草本植物，藥用成分包含蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類和多糖類等化合物，藥用價值豐富。藥用植物中發(fā)揮防病治病功能的有效成分是藥用植物區(qū)別于其他作物最主要的特征，有效成分主要是藥用植物生長過程中積累的代謝產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)藥用植物次生代謝及有效成分積累的重要影響因子。因此，研究轉(zhuǎn)錄因子對次生代謝產(chǎn)物的積累的影響尤為重要。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［1］，參與調(diào)控植物藥效成分合成，目前，已有不少從植物中克隆MYB基因啟動子的報道。如從黃芪中克隆出了AmMYB44的啟動子［2］；從銀杏中克隆出了GbMYBF2的啟動子［3］；從丹參中克隆出了SmMYB7的啟動子［4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MYB家族基因啟動子序列中除含有啟動子TATA-box、CAAT-box等基本的組成元件外，還含有一些特有的與激素、抗逆境、組織器官發(fā)育等相關(guān)順式作用元件，推測對MYB轉(zhuǎn)錄因子的激活和誘導(dǎo)起到調(diào)控作用。但虎杖MYB基因啟動子的相關(guān)研究尚未見報道。

藥用植物課題組前期從虎杖中分離得到1個新的轉(zhuǎn)錄因子PcMYB1（GenBank登錄號為KY495789）［5］，生物信息學(xué)分析PcMYB1序列C端存在一個抑制結(jié)構(gòu)域基序pdLNL［D/E］LXI［G/S］，并且利用酵母單雜交試驗、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等證明PcMYB1具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，對植物木質(zhì)素合成具有負調(diào)控作用［6］。本研究擬用 hiTAIL-PCR［7］方法獲得PcMYB1的啟動子序列，并構(gòu)建啟動子植物表達載體，通過毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化以及GUS組織化學(xué)染色分析PcMYB1啟動子活性。旨為后續(xù)研究PcMYB1參與植物次生代謝產(chǎn)物合成的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院柳忠玉副教授鑒定為虎杖植株，植于長江大學(xué)苗圃，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ATCC15834、大腸桿菌菌株DH5α、載體pCAMBIA1300G、pMD18-T等由藥用植物課題組保存?？敲顾兀╧anamycin，Kan）、潮霉素（hygromycin，Hyg）、乙酰丁香酮、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自Tiangen公司；限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4連接酶購自TaKaRa公司；所用引物和測序服務(wù)由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PcMYB1啟動子的克隆與序列分析 利用hiTAIL-PCR法［7］擴增虎杖PcMYB1的啟動子序列，以藥用植物課題組已經(jīng)獲得的PcMYB1基因（GenBank登錄號為KY495789）序列為基礎(chǔ)，設(shè)計3條特異巢式引物SP0-1、SP1-1和SP2-1，結(jié)合4條LAD簡并引物及AC1引物（表1）進行3輪PCR擴增。

以虎杖基因組DNA為預(yù)擴增模板，LAD1-LAD4、SP0-1為引物進行預(yù)擴增；以預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋40倍后作為模板，AC1、SP1-1為引物進行第一輪擴增；再以第一輪擴增產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，AC1、SP2-1作為引物進行第二輪擴增。將PCR產(chǎn)物特異性條帶回收并測序。所獲序列經(jīng)過同源比對確定為PcMYB1的5′側(cè)翼序列后，設(shè)計并合成引物P0-F和P0-R（表1），以虎杖葉片基因組DNA為模板進行 PCR 擴增：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序，重組子命名為pMD18-T-P0。獲得虎杖PcMYB1啟動子序列后，利用軟件PlantCARE預(yù)測該啟動子潛在的順式作用元件。

1.2.2 PcMYB1啟動子表達載體的構(gòu)建 根據(jù)啟動子測序和序列分析結(jié)果，在全長啟動子P1（-2 884-+1）的基礎(chǔ)上，設(shè)計3個5′端缺失啟動子（圖1），分別是 P2（-2 259-+1）、P3（-1 807-+1）和P4（-1 362-+1）；并根據(jù)其序列設(shè)計對應(yīng)引物（表1）。以質(zhì)粒pMD18-T-P0為模板，引物P1-F、pro-R擴增全長啟動子P1；引物P2-F、pro-R擴增5′端缺失啟動子P2；引物P3-F、pro-R擴增5′端缺失啟動子P3；引物P4-F、pro-R擴增5′端缺失啟動子P4。PCR產(chǎn)物經(jīng)過雙酶切（PstⅠ+BamH I）后回收目的片段；與經(jīng)過同樣的酶切掉35S啟動子的pCAMBIA1301G載體連接。

1.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化 用電轉(zhuǎn)化法將植物表達載體P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS以及陽性對照35S∷GUS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ATCC15834菌株。挑取陽性單菌落于5 mL TY液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，28℃條件下180 r/min培養(yǎng)48 h。取菌液100 μL涂布到TY固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），28℃培養(yǎng)48 h。將菌落用涂棒刮下，用1/2MS液體培養(yǎng)基（含有100 μmol/L乙酰丁香酮）重懸，振蕩至A600為0.8左右。選取生長健壯的虎杖無菌苗，葉片切成1 cm×1 cm小塊，并置于準備好的菌液中浸泡10 min，用滅菌濾紙吸干葉片表面的菌液，然后將葉片轉(zhuǎn)移至1/2MS固體培養(yǎng)基（含7.5 μg/mL潮霉素），于黑暗中進行篩選培養(yǎng)并觀察毛狀根的生長狀態(tài)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因虎杖毛狀根的PCR檢測 利用CTAB法提取虎杖毛狀根的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用引物Hyg-F和Hyg-R（表1）擴增潮霉素基因Hyg，預(yù)期擴增片段大小為500 bp；利用引物GUS-F和GUS-R（表1）擴增GUS，預(yù)期擴增片段大小為1 080 bp。

圖1 PcMYB1啟動子系列缺失片段表達載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of expression vector construction of serial deletion fragments of PcMYB1 promoter

1.2.5 轉(zhuǎn)基因虎杖毛狀根的GUS染色檢測 選取經(jīng)PCR鑒定為陽性的毛狀根進行GUS染色分析。參照Jefferson等［8］方法略加修改，將毛狀根完全浸沒在事先預(yù)冷的90%丙酮溶液中，室溫放置20 min。再用預(yù)冷的去離子水沖洗，將丙酮溶液完全沖洗干凈，再將毛狀根浸沒于GUS染色劑中，37℃過夜。隨后將GUS染色處理的毛狀根置于濃度為70%的乙醇中脫色30 min，最后用95%的乙醇洗脫，并觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 PcMYB1啟動子序列的獲得

在已經(jīng)獲得的PcMYB1（GenBank登錄號為KY495789）序列基礎(chǔ)上，利用hiTAIL-PCR法擴增虎杖PcMYB1的啟動子序列。用1%瓊脂糖對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，預(yù)擴增的PCR產(chǎn)物均無特異條帶（圖2-A）。第一輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物出現(xiàn)特異條帶（圖2-B）。第二輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物仍然是特異條帶（圖2-C），將該特異條帶回收。測序后與PcMYB1進行同源性比對，確認其為PcMYB1的5′側(cè)翼序列。再以虎杖基因組DNA為模板，通過PCR擴增最終獲得PcMYB1啟動子序列2 884 bp（圖3），命名為proPcMYB1（GenBank登錄號為MT811057）。

2.2 PcMYB1啟動子的生物信息學(xué)分析

利用PlantCARE對克隆獲得的啟動子序列中可能存在的順式作用元件進行預(yù)測，分析PcMYB1啟動子元件的類型、數(shù)量及位置（表2和圖3）。其中，+1為翻譯起始位點，負值表示從翻譯起始密碼子開始的5′端上游序列。PcMYB1啟動子包含多個真核生物啟動子保守元件TATAbox和CAAT-box。此外，還有光響應(yīng)元件GT1-motif、G-box，涉及光反應(yīng)的AE-box、AT1-box、TCT-box、I-box元件，涉及厭氧誘導(dǎo)順式作用的ARE元件，涉及低溫誘導(dǎo)順式作用的LTR元件，還有參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的CGTCA-motif和TGACG-motif元件。

2.3 植物表達載體的構(gòu)建與鑒定

圖2 PcMYB1的hiTAIL-PCR擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.2 Analysis of PcMYB1 by electrophoresis of hiTAILPCR amplification products

根據(jù)啟動子測序和生物信息學(xué)分析結(jié)果，將全長啟動子P1和3個5′端缺失啟動子（P2、P3、P4）分別與GUS基因融合構(gòu)建植物表達載體（圖1）。對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，結(jié)果與預(yù)期片段大小一致，P1、P2、P3以及P4的片段大小分別為2 692、2 180、1 762和1 281bp。表明4個植物表達載體構(gòu)建成功，分別命名為P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS 和 P4∷GUS（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR鑒定

將重組質(zhì)粒P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS以及陽性對照質(zhì)粒35S∷GUS轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834，然后分別侵染虎杖葉片。暗培養(yǎng)1個月后，選取潮霉素抗性平板上生長良好的毛狀根，提取毛狀根基因組DNA并PCR檢測Hyg（圖5-A）和GUS（圖5-B）。野生型毛狀根均無特異基因擴增條帶，陽性對照35S∷GUS毛狀根能檢測出GUS和 Hyg，并 且 P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS毛狀根也均能檢測出GUS和Hyg，且Hyg實際大小為500 bp，GUS實際大小為1 080 bp，說明成功獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。

圖3 PcMYB1啟動子的分析Fig.3 Analysis of PcMYB1 promoter

表2 PcMYB1啟動子順式作用元件預(yù)測分析Table 2 PcMYB1 promoter cis-acting element prediction analysis

圖4 重組載體的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant vectors

2.5 轉(zhuǎn)基因毛狀根GUS組織化學(xué)染色

對轉(zhuǎn)基因毛狀根進行GUS染色，野生型毛狀根不能染成藍色，陽性對照35S∷GUS毛狀根呈藍色，P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和 P4∷GUS毛狀根也均能染成藍色，但與陽性對照相比顏色較淺。證明全長啟動子P1（-2 884-+1）和3個5′端缺失啟動子 P2（-2 259-+1）、P3（-1 807-+1）、P4（-1 362-+1）均能驅(qū)動GUS報告基因的表達，但啟動活性都比CaMV35S啟動子的啟動活性弱（圖6）。

圖5 轉(zhuǎn)基因毛狀根的Hyg（A）和GUS（B）檢測Fig.5 Hyg (A) and GUS (B) detection of transgenic hairy roots

3 討論

啟動子是研究基因功能的重要組成部分，通常包含多種不同的順式作用元件，與基因功能調(diào)節(jié)有關(guān)。目前，從藥用植物中克隆啟動子已有不少報道，如從黃花蒿（Artemisia annua L.）中克隆了乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）基因啟動子［9］，從刺五加（Eleutherococcus senticosus）中克隆法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）基因啟動子［10］，從陽春砂（Amomum villousm）中克隆萜類合酶基因AvTPS1啟動子［11］，從滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）中克隆環(huán)烯醚萜氧化酶（iridoid oxidase，CrIDO）基因的啟動子［12］。但是虎杖相關(guān)基因啟動子的克隆鮮有報道。本研究在前期獲得PcMYB1的cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用hiTAIL-PCR成功獲得了PcMYB1啟動子序列。

圖6 轉(zhuǎn)基因毛狀根的GUS組織化學(xué)染色Fig.6 GUS histochemical staining of transgenic hairy roots

通過生物信息學(xué)分析，本研究克隆的PcMYB1啟動子具有CAAT-box和TATA-box等豐富的核心調(diào)控元件。并且PcMYB1啟動子在-1 021、-1 147和-1 808 bp處有3個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif），在-1 072和-2 713 bp處有2個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif）。大豆GsMYB15啟動子含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，該基因通過MeJA信號途徑對蟲害觸發(fā)的植物自身免疫反應(yīng)進行調(diào)控［13］。水稻萜類合成酶基因啟動子PRJA140含有多種茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，對其啟動子活性分析表明該基因的表達不僅受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，同時受白葉枯菌誘導(dǎo)，可以用于水稻的抗性改良［14］。在蕎麥中，F(xiàn)tMYB13、FtMYB14、FtMYB15和 FtMYB16的表達均受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，進而抑制蕎麥中的蘆丁生物合成［15］。本研究PcMYB1啟動子含有多個響應(yīng)MeJA的元件，但該基因啟動子是否存在茉莉酸甲酯調(diào)節(jié)機制有待深入研究。很多MYB轉(zhuǎn)錄因子的啟動子中含有光響應(yīng)元件，如荔枝LcMYB1［16］和葡萄VvMYBF1［17］啟動子含有多個光響應(yīng)元件，其啟動子活性受到光的誘導(dǎo)，進而調(diào)控原花青素生物合成。PcMYB1啟動子中也存在數(shù)量較多的光反應(yīng)元件，推測該基因的表達可能受光的調(diào)控。前期實驗發(fā)現(xiàn)紫外照射處理可誘導(dǎo)虎杖葉片中PcMYB1的高表達［6］，表明PcMYB1可能響應(yīng)紫外脅迫，但是PcMYB1響應(yīng)紫外機制還有待探究。啟動子序列中低溫反應(yīng)元件（LTR）與抗寒相關(guān)。麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）的JcHKL1和JcHKL2啟動子包含LTR元件，低溫條件下能顯著提高麻風(fēng)樹的抗寒能力［18］。PcMYB1啟動子中也發(fā)現(xiàn)LTR元件，是否參與抗寒仍需試驗證明。

4 結(jié)論

獲得PcMYB1的啟動子序列長為2 884 bp，PcMYB1啟動子包含多個保守元件。通過毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化以及GUS組織化學(xué)染色證明PcMYB1啟動子具有啟動活性。