趙靜霞，高宏杰，貢磊磊，李 君

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院麻醉科，北京 100091；2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；3.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部，北京 100026)

盆腔炎(pelvic inflammatory disease，PID)是指女性上生殖道(子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢或盆腔腹膜)感染引起的炎癥，是一種具有嚴重生殖后遺癥的女性生殖道疾病[1]。2013—2014年美國國家健康與營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果顯示，250萬18～44歲女性獲得過PID診斷[2]；2004年，由北京大學第一醫(yī)院牽頭組織的全國14家醫(yī)院的調(diào)查結(jié)果顯示，婦科門診就診患者中，PID患病率約為10.1%[3]。PID是育齡女性的常見病、多發(fā)病，若未得到及時、積極、正確診療，可引起輸卵管囊腫、肝周圍炎等近期后遺癥和不孕癥、異位妊娠、慢性盆腔炎及PID反復發(fā)作等遠期后遺癥，嚴重影響女性健康及生活質(zhì)量，增加家庭和社會負擔。PID的治療主要以廣譜、經(jīng)驗性抗菌藥物治療為主，必要時進行手術(shù)治療[4-6]。但臨床上在治療PID時，存在抗菌藥物應用不當、治療療程不夠以及濫用抗菌藥物等問題，使得常規(guī)西醫(yī)治療存在一定的局限性。中藥治療PID療效確切、不良反應小，具有獨特的優(yōu)勢[7]。

根據(jù)臨床表現(xiàn)，PID屬于中醫(yī)學中“熱入血室”“婦人腹痛”及“帶下病”等范疇，其病機為濕熱之邪趁虛入體，與沖任之氣血相搏，瘀滯胞宮，或積郁肝經(jīng)，致氣滯血瘀，久則成癥，而瘀阻沖任胞脈，不通則痛[8]。康婦炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草11味中藥組成的復方制劑，具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，針對PID，藥證相符，臨床療效確切[7]。梁旭東等[9]的研究納入了438例PID患者，隨機觀察不同治療方案的療效，發(fā)現(xiàn)康婦炎膠囊聯(lián)合抗菌藥物治療PID的療效顯著，且安全可靠。蔡競等[10]發(fā)現(xiàn)，康婦炎膠囊可通過下調(diào)PID兔前炎癥細胞因子[白細胞介素(IL)8]和腹腔粘連相關(guān)細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達，并提高抗炎因子(IL-4、IL-10)的表達，調(diào)整致炎和抗炎的動態(tài)平衡，促使PID性疾病的康復。何延浩等[11]建立了大鼠PID后遺癥模型，發(fā)現(xiàn)康婦炎膠囊能夠減輕PID模型大鼠的子宮炎癥，提高模型大鼠的臟器指數(shù)及腹腔巨噬細胞的吞噬功能，調(diào)整大鼠機體免疫能力，從而改善大鼠PID后遺癥。目前，關(guān)于康婦炎膠囊治療PID多集中于臨床及藥效學研究，其治療PID的分子機制尚無文獻報道。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法預測康婦炎膠囊治療PID的活性成分及其作用靶點，為進一步的體內(nèi)試驗和臨床應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 康婦炎膠囊化學成分來源

基于中藥分子機制生物信息學分析工具(bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，分別檢索蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草等11味中藥的所有化學成分，建立康婦炎膠囊化學成分庫。

1.2 康婦炎膠囊靶標預測和PID靶標收集

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫，收集11味中藥化學成分潛在的靶點，合并所有靶點并去重，建立康婦炎膠囊候選靶標庫。在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)中，以“pelvic inflammatory disease”“pelvic infection”為關(guān)鍵詞，對PID疾病靶標進行檢測，對收集的靶標去重，采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對靶點進行標準化，建立PID靶標庫。

1.3 康婦炎膠囊藥物靶標與PID靶標核心網(wǎng)絡構(gòu)建、核心靶標功能及通路分析

基于String 10.5數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，提取康婦炎膠囊候選靶標與PID相關(guān)靶標相互作用信息，設置蛋白種類為“homo sapines”，最高置信度參數(shù)評分>0.4，其他參數(shù)不變。對參數(shù)“degree”“betweenness”和“neighborhood”進行分析，取值方式為“degree”>中位數(shù)，進一步計算“betweenness”和“neighborhood”，取滿足3個拓撲結(jié)構(gòu)特征值均>中位數(shù)的節(jié)點的靶標與其相互作用關(guān)系導入Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建康婦炎膠囊成分靶標及PID靶標核心網(wǎng)絡，并將這些核心靶標導入DAVIA 6.7數(shù)據(jù)庫，采用基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析(http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/)分別對核心網(wǎng)絡靶標進行分析。

2 結(jié)果

2.1 康婦炎膠囊化學成分及其靶標預測

經(jīng)過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，篩選整理獲得康婦炎膠囊中11味中藥的化學成分共249個，預測靶標1 594個，其中蒲公英化學成分4個，預測靶標89個；敗醬草化學成分17個，預測靶標265個；薏苡仁化學成分3個，預測靶標48個；赤芍化學成分9個，預測靶標50個；蒼術(shù)化學成分15個，預測靶標314個；當歸81個成分，預測靶標1 185個；川芎84個，預測靶標946個；香附12個，預測靶標450個；延胡索35個，預測靶標563個；澤瀉14個，預測靶標168個；白花蛇舌草4個，預測靶標165個。其中29個成分重復，這些藥物中的靶標之間有所重合(見表1)。蔡少青等[12]認為，中藥不同化學成分可通過相繼與靶標分子結(jié)合，形成疊加效應，共同發(fā)揮作用。對上述靶標合并去重后，共獲得1 594個靶標。

2.2 康婦炎膠囊治療PID核心靶標網(wǎng)絡分析

通過OMIM數(shù)據(jù)庫，收集PID相關(guān)靶標，經(jīng)過DAVID數(shù)據(jù)庫標準化，去重后共獲得94個靶標?；赟TRING數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建康婦炎膠囊潛在靶標與疾病靶標之間的相互作用網(wǎng)絡。根據(jù)“degree”>中位數(shù)為節(jié)點，以此為標準，篩選“degree”“betweenness centrality”和“neighborhood centrality”3個拓撲結(jié)構(gòu)特征值均>中位數(shù)的節(jié)點為關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡，根據(jù)以上條件篩選出關(guān)鍵靶標460個，根據(jù)“degree”顯示前150個靶標，見圖1。圖中，節(jié)點大小與“degree”呈正相關(guān)，其中康婦炎膠囊化學成分靶標143個，PID疾病靶標11個，藥物靶標和疾病靶標共4個。共有靶標有神經(jīng)型一氧化氮合酶(NOS1)、CC趨化因子2(CCL2)、SRY相關(guān)高遷移率組蛋白9(Sox9)及前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS2)。NOS1是一氧化氮合酶3種亞型之一，也是炎癥的重要介質(zhì)之一，研究結(jié)果表明，抑制NOS1可阻止AP1轉(zhuǎn)錄因子亞基的核異位，減弱炎癥基因的轉(zhuǎn)錄進而抑制炎癥反應[13]。CCL2是趨化因子中CC家族重要成員，也稱為單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，PID患者血漿中MCP-1表達顯著升高，血漿MCP-1濃度的評估可作為PID診斷的生物標志物[14]。此外，慢性非細菌性前列腺炎(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)相關(guān)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，CPPS患者血漿中MCP-1水平明顯高于健康人，MCP-1可作為CPPS診斷的生物標志物[15]。SOX9作為腫瘤壞死因子α(TNF-α)的下游靶標，在牙髓炎和免疫反應中發(fā)揮著重要作用[16]。PTGS2也稱為環(huán)氧合酶2(COX2)，也是重要的炎癥介質(zhì)，而COX2衍生的前列腺素是慢性前列腺炎和CPPS的重要治病因素[17]。

圖1 康婦炎膠囊治療PID核心靶標網(wǎng)絡圖Fig 1 Network diagram of core targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

2.3 康婦炎膠囊與PID核心靶標功能及通路分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫中GO和KEGG對150個藥物和疾病靶標進行功能和通路分析，對數(shù)據(jù)庫中富集的P值由小至大排序居前20位的生物學過程進行深入分析，以生物學過程為縱坐標，以基因比率為橫坐標構(gòu)建氣泡圖，結(jié)果見圖2(A)。這些核心靶標主要富集于ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎癥反應(inflammatory response)、蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(protein kinase B signaling)以及脂多糖介導的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)等生物學過程。

此外，同樣對KEGG通路中P值由小到大排序居前20位的通路進行分析，以KEGG通路為縱坐標，以基因比率為橫坐標構(gòu)建氣泡圖，結(jié)果見圖2(B)?？梢姡?50個核心靶標主要富集于查加斯病(美國錐蟲病)[Chagas disease (American trypanosomiasis)]、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)以及T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)。

2.4 康婦炎膠囊治療PID的多維網(wǎng)絡分析

以KEGG通路富集分子中P值由小至大排序居前20位的通路制作中藥-成分-靶標-通路多維網(wǎng)絡分析，涉及11味藥物的164個成分以及107個靶標，見圖3。蒲公英中主要含有蒲公英甾醇、酚類和多糖類成分等，上述成分具有抗炎和抗菌作用，如蒲公英甾醇和蒲公英皂苷對脂多糖誘導的炎癥有顯著的抑制作用，其作用機制可能是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路發(fā)揮抗炎作用[18-20]。敗醬草中富含黃酮、甾體、皂苷和鞣質(zhì)等成分，其中白花敗醬醇具有較強的抗炎作用[21]。白芍中的芍藥苷可抑制炎癥因子TNF-α、Il-1β和iNOS的分泌，降低IκB磷酸化，通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位改善炎癥[22]。當歸中的當歸揮發(fā)油能夠改善LPS誘導炎癥模型[23]。川芎中的洋川芎內(nèi)酯、A,Z-藁本內(nèi)酯、新蛇床內(nèi)酯和Z-藁本內(nèi)酯可能通過COX-2、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)、蛋白激酶C(PKC)、Janus激酶1(JAK1)、JAK2、JAK3及NF-кB抑制蛋白激酶β(IKKβ)、TNF-α，阻礙炎癥信號傳遞[24]。香附中的Alpha-Cyperone同樣能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子COX-2和IL-6，其作用機制可能通過調(diào)控NF-κB有關(guān)[25]。延胡索中的黃連堿、小檗堿、巴馬汀、二氫血根堿和去氫紫堇堿可通過影響PI3K、JAK、PKC、ERK、IKKβ及TNF-α所在信號通路發(fā)揮抗炎作用[26]。澤瀉中的澤瀉總?cè)凭哂辛己玫目寡鬃饔肹27]。白花蛇舌草也是治療PID的佳品[28]?？祴D炎膠囊中11味藥材所含的成分可能通過影響TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路和T細胞受體信號通路等通路中的靶標IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1、PTGS2、CCL2及NOS3改善炎癥反應。

A.GO功能富集分析；B.KEGG通路富集分析A.GO functional enrichment analysis;B.KEGG pathway enrichment analysis圖2 康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵靶標基因功能分析Fig 2 Gene function analysis on key targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

圖3 康婦炎膠囊“藥材-成分-靶標-通路”網(wǎng)絡圖Fig 3 Network diagram of “herb-compounds-target-pathway”of Kangfuyan capsule

3 討論

PID多因產(chǎn)后、剖宮產(chǎn)后、流產(chǎn)后以及婦科手術(shù)后細菌進入創(chuàng)面感染而致，近年來，多由下生殖道的性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)上行感染至上生殖道而造成。PID多數(shù)以疼痛為主要表現(xiàn)。目前，單用抗菌藥物治療的用藥時間長，日后容易遷延，而配合清熱解毒、理氣活血的中藥口服治療，可提高PID的治愈率。此外，PID后遺癥有組織破壞、粘連、增生及瘢痕。采用中醫(yī)活血化瘀的方法治療，有助于恢復破壞組織、松解粘連、緩解增生及瘢痕形成。中藥復方制劑康婦炎膠囊具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，能夠有效治療PID和緩解PID后遺癥。但其作用機制尚未闡明，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，結(jié)合國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)平臺和分析軟件，分析了康婦炎膠囊治療PID的潛在靶標，并對關(guān)鍵靶標進行了生物信息學分析，構(gòu)建了康婦炎膠囊治療PID的多維網(wǎng)絡圖。

康婦炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁及赤芍等11味中藥組成，通過相關(guān)數(shù)據(jù)獲得249種成分，上述成分潛在的靶標有1 594個，其中一些成分可能是康婦炎膠囊中的質(zhì)量標志物，通過與相應靶標相結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，從而改善PID及其后遺癥[29]。PID疾病靶標收集結(jié)果顯示，PID發(fā)病機制中94個靶標可能通過直接或間接作用影響PID的發(fā)生發(fā)展過程。中藥的化學實體與生命體分子網(wǎng)絡的交互作用是中藥治療疾病的重要方式[30]。在這些藥物靶標和疾病靶標中，NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標是藥物和疾病共有靶標，這4個靶標均為炎癥的重要介質(zhì)，在PID或炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，因此，其可能在康婦炎膠囊治療PID中發(fā)揮主導作用。進一步的生物信息學分析結(jié)果顯示，藥物和疾病組成的核心靶標參與了炎癥反應、LPS介導的信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控、PI3K信號的正向調(diào)控等生物學過程，其中LPS通過識別細胞膜上的TLR4受體誘發(fā)炎癥反應過程[31]。此外，這些核心靶標參與TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路及T細胞受體信號通路等炎癥信號通路，表明康婦炎膠囊可能通過干預上述通路中的核心靶標參與了PID及其后遺癥的治療。中藥-成分-靶標-通路分析結(jié)果顯示，康婦炎膠囊中的成分不僅可以通過影響NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標發(fā)揮藥效，還可以通過干預TNF信號通路、趨化因子信號通路及T細胞受體信號通路等通路中的IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1及NOS3等靶標參與PID的治療過程。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，建立了康婦炎膠囊中11味中藥的中藥-成分-靶標(藥物和疾病)-通路網(wǎng)絡，顯示了中藥多成分與靶標之間的關(guān)聯(lián)，并且明確了康婦炎膠囊藥效物質(zhì)及其發(fā)揮治療PID的分子機制，為康婦炎膠囊治療PID及其后遺癥提供了臨床依據(jù)，也為進一步的體內(nèi)外試驗提供了重要參考。