毛 璐，王曉雪，劉慧芳，林 平，張伯松

(1.北京積水潭醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100035；2.中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029；3.北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，北京 100035)

骨感染是骨科醫(yī)師面對(duì)的最具挑戰(zhàn)性的疾病之一，因?yàn)槿響?yīng)用抗生素在骨感染局部特別是存在有無血運(yùn)的骨組織中難以達(dá)到有效的治療濃度[1]。研究結(jié)果表明，骨科感染患者中，約49.72%由革蘭陰性菌引起，排序居前3位的為銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌檢出率分別為54.29%和31.43%，上述細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感性>70%[2-4]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜脈給予美羅培南0.5 g，30～70 min后，美羅培南的骨濃度為其血藥濃度的20%，為0.4～5.74 μg/g，給藥80 min后，骨組織中幾乎測(cè)不到美羅培南[5]。有效提高骨感染局部藥物濃度，才可能發(fā)揮抗感染藥的作用[6]。因此，臨床嘗試將美羅培南加入骨水泥中，用于骨感染的局部治療，取得了較為滿意的療效[7-8]。但僅為臨床個(gè)案報(bào)道或療效觀察，其釋放規(guī)律尚不明確。為此，本研究進(jìn)行美羅培南骨水泥的體外釋放研究，觀察其釋放規(guī)律，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Quattro PremierXE型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Acquity UPLC型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；電噴霧離子化源(美國Waters公司)；Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司)；美國Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)(德國默克密理博公司)。

1.2 藥品與試劑

2 方法

2.1 模擬體液中美羅培南的檢測(cè)方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)溶液制備：精密稱取美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品，加超純水稀釋獲得儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為1 mg/ml，美羅培南-d6對(duì)照品內(nèi)標(biāo)液質(zhì)量濃度為40 μg/ml。

2.1.2 線性關(guān)系考察、精密度和準(zhǔn)確度：精密吸取空白模擬體液950 μl置于1.5 ml離心管中，精密加入含美羅培南儲(chǔ)備液50 μl，用空白模擬體液進(jìn)行等比稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78及0.39 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。取空白模擬體液加入儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度為1.85、5.55及16.67 μg/ml的低、中及高3個(gè)質(zhì)控樣品。樣本檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[9]，在0.39～50 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=0.223 1X-0.007 8，r2=0.999 4。質(zhì)控濃度實(shí)測(cè)值為1.885、5.656及16.967，均在合格范圍內(nèi)。日間和日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的回收率均>85%。

2.2 體外釋放試驗(yàn)

2.2.1 美羅培南骨水泥的制備：于100級(jí)層流臺(tái)內(nèi)混合含美羅培南10%(W/W)的骨水泥。將定量的注射用美羅培南和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末置于研缽中充分混合，加入骨水泥標(biāo)配的固化液攪拌，之后灌入不銹鋼模具中，制成長(zhǎng)度為10 mm、直徑為3 mm的圓柱型美羅培南骨水泥藥柱，待充分凝固后從模具中取出置入滅菌離心管中。用分析天平測(cè)定藥柱的質(zhì)量。

2.2.2 體外釋放試驗(yàn)：于裝有美羅培南藥柱的離心管中加入模擬體液1 ml，放置于37 ℃恒溫箱中。采用等距浸出法[10]觀察其釋放規(guī)律，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道調(diào)整時(shí)間點(diǎn)[11]，分別于5 min，0.5、1、2、8、19、32、50、72、98、128、165、200、242、288、338、392、455、512及578 h，將浸泡的骨水泥藥柱取出置于新的1 ml模擬體液中，之前的浸出液為待測(cè)液，置于-80 ℃保存待測(cè)。

3 結(jié)果

自制的美羅培南骨水泥藥柱平均質(zhì)量為(86.16±8.76) mg(n=3)，平均美羅培南含量為(7.83±0.80) mg。藥物釋放時(shí)間曲線見圖1，累積釋藥百分率取樣時(shí)間曲線見圖2。測(cè)得24 d累計(jì)釋放率為6.00%，釋藥峰值出現(xiàn)在2 h，之后釋藥速率逐漸降低，19 h累計(jì)釋放量達(dá)總釋放量的92.37%，72 h可以達(dá)到總釋放量的98.70%，釋藥規(guī)律數(shù)學(xué)模型擬合見表1。體外釋放符合Weibull方程，r=0.915 1。

圖1 藥物釋放-時(shí)間曲線Fig 1 Drug release-time curve

圖2 美羅培南骨水泥累積釋藥-時(shí)間曲線Fig 2 Cumulative release-time curve of meropenem bone cement

表1 釋藥規(guī)律的數(shù)學(xué)模型擬合Tab 1 Mathematical model fitting of the drug-release pattern

4 討論

4.1 選擇美羅培南加入骨水泥的原因

在骨水泥中加入的抗生素要求水溶好、殺菌劑、對(duì)組織無毒、固體粉末即粉針劑型、致敏性低、能夠覆蓋骨感染的病原體以及對(duì)熱穩(wěn)定[12-13]。針對(duì)革蘭陽性菌，國內(nèi)外比較公認(rèn)的是加入萬古霉素；針對(duì)革蘭陰性菌，國外多選用氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素、妥布霉素等[14]。國內(nèi)也曾嘗試將依替米星粉針劑型加入骨水泥[11]，但該劑型已停產(chǎn)，目前國內(nèi)上市的氨基糖苷類抗生素均為注射液，無法滿足要求。氟喹諾酮類藥物因其在局部高濃度時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性而不建議加入骨水泥[15]。頭孢菌素和青霉素類抗生素由于致敏性高，不建議加入骨水泥中。碳青霉烯類藥物的抗菌譜較氨基糖類及氟喹諾酮類藥物廣，致敏性低，能夠基本覆蓋骨感染的常見革蘭陰性致病菌及耐藥菌。臨床常用的碳青霉烯類抗生素有亞胺培南西司他丁和美羅培南。亞胺培南西司他丁是復(fù)方制劑，局部應(yīng)用西司他丁無效，且占用有限的骨水泥載藥空間。骨水泥聚合過程中會(huì)產(chǎn)熱，通常峰值出現(xiàn)在15～17 min，最高溫度為62.3 ℃，之后逐漸降低[16]。因此，對(duì)于載入的抗生素有一定的熱穩(wěn)定性要求。美羅培南熱穩(wěn)定性優(yōu)于亞胺培南，在60 ℃條件下放置1～2 d，注射用美羅培南樣品降解僅為2%～4%[17]。因此，美羅培南可耐受骨水泥聚合時(shí)的短暫高溫。Gálvez-López等[18]的研究中，應(yīng)用微生物法(大腸桿菌)檢測(cè)美羅培南骨水泥洗脫液的濃度，可以證明加入骨水泥聚合后美羅培南仍可保持抗菌活性。美羅培南較為常見的不良反應(yīng)包括腹瀉、腸道菌群紊亂、肝酶升高、白細(xì)胞減少以及神經(jīng)精神系統(tǒng)不良反應(yīng)[19]。由于局部應(yīng)用抗生素骨水泥后全身吸收很少，可以避免全身用藥的不良反應(yīng)[14]。因此，局部使用美羅培南骨水泥有其優(yōu)勢(shì)。

4.2 美羅培南加入骨水泥中的劑量

《假體周圍感染國際共識(shí)》中提及，有將0.5～4 g的美羅培南加入骨水泥(40 g)占位器的報(bào)道[20]。矯形骨科將藥物加入骨水泥時(shí)需要在考慮藥物釋放的同時(shí)考慮強(qiáng)度問題，而創(chuàng)傷骨科抗生素骨水泥無需承重，因此加入的藥物可適當(dāng)增加。有研究將美羅培南分別以1.25%、2.5%、5%及10%的濃度與骨水泥混合測(cè)定其體外釋放，其中10%混合濃度藥物釋放最多，時(shí)間最長(zhǎng)可以達(dá)27 d，比5%藥物濃度釋放增加44.7%[21]。因此，本研究選擇美羅培南與骨水泥的質(zhì)量比為10%(W/W)。

4.3 美羅培南骨水泥的釋放量

既往文獻(xiàn)報(bào)道，5%～10%的美羅培南骨水泥累計(jì)釋放量為1.2%[21]～2.70%[22]。本次試驗(yàn)中，美羅培南骨水泥24 d累計(jì)釋放率為6.00%，較其他研究高。分析主要有以下兩方面原因：(1)本研究采用的美羅培南骨水泥較文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)小，文獻(xiàn)報(bào)道的為直徑12 mm、長(zhǎng)度16 mm的骨水泥柱[21]和直徑6 mm、長(zhǎng)度12 mm的骨水泥藥柱[22]，本研究采用直徑3 mm、長(zhǎng)度10 mm骨水泥柱。體積越大的骨水泥內(nèi)部的藥物釋放越困難，由此可以推斷，在實(shí)際臨床使用中，如果自制的美羅培南骨水泥尺寸越大，則整體釋放率越低。(2)本研究取樣時(shí)間早期間隔較文獻(xiàn)時(shí)間短。由釋放曲線可知藥物主要在早期快速釋放，在此時(shí)測(cè)定間隔短則形成的漏槽效應(yīng)更為明顯，可以促進(jìn)藥物釋放，同時(shí)更加接近于植入人體后的真實(shí)情況，因植入人體后早期局部引流量大。本研究中觀察到在前19 h內(nèi)釋放量達(dá)總釋放量的92.37%，前72 h可以達(dá)到總釋放量的98.70%，后期釋放量很少。Gálvez-López等[18]研究結(jié)果顯示，美羅培南骨水泥在第4日及以后較前3 d有明顯的洗脫降低，釋放的絕大多數(shù)藥物集中在前3 d，這與本研究觀察的結(jié)果類似。

4.4 美羅培南骨水泥釋放實(shí)驗(yàn)的局限性

美羅培南有β-內(nèi)酰胺環(huán)，與不同輸液配伍后，隨時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)發(fā)生不同程度的降解，如與復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖注射液等輸液配伍后8 h，美羅培南的含量降低32.2%～6.2%不等[23]；與0.9%氯化鈉注射液等4種輸液配伍12 h可降解10%～30%不等[24]。既往美羅培南骨水泥釋放研究采用的0.9%氯化鈉溶液[22]及磷酸鹽緩沖液[21]作為洗脫液，均有長(zhǎng)時(shí)間的浸泡過程，但在分析中未考慮溶劑中美羅培南的降解問題，而實(shí)測(cè)發(fā)現(xiàn)5%、10%美羅培南骨水泥抑菌活性仍至少能維持3周[21-22]?？赏茰y(cè)從骨水泥中釋放的美羅培南隨著取樣間隔的延長(zhǎng)會(huì)在洗脫液中有一定的降解，實(shí)際的釋放量會(huì)較表觀釋放量高。本研究的洗脫液采用模擬體液，添加有更加豐富的離子，與既往研究相比可以更真實(shí)地模擬美羅培南骨水泥在體內(nèi)的釋放環(huán)境。本研究能夠在一定程度上反映美羅培南骨水泥的釋藥規(guī)律，但美羅培南骨水泥植入體內(nèi)后是否能維持較長(zhǎng)時(shí)間的抗菌作用，值得進(jìn)一步研究。