陳小傲，朱建新，劉 洋,3，薛致勇，曲克明

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 200071；3.大連海洋大學，遼寧 大連 116023； 4.海陽市黃海水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 265100）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中，合適的養(yǎng)殖方法對于提高經(jīng)濟效益具有重大意義。Dada等[1]認為，投喂方式、投喂頻率、投喂量等均會影響?zhàn)B殖生物的生長。研究發(fā)現(xiàn)，投喂頻率不僅影響水產(chǎn)動物的生長率和死亡率，還會影響?zhàn)B殖系統(tǒng)的水質[2]。過高的投喂頻率會降低飼料利用率，殘余的飼料溶失到養(yǎng)殖水體中會影響水質，增大了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的凈水負荷和流水養(yǎng)殖系統(tǒng)的換水率，從而增加了養(yǎng)殖人員的勞動強度和生產(chǎn)成本[3-4]。為提高養(yǎng)殖效益，國內外學者對一些水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的最佳投喂頻率進行了探索性研究，如飼養(yǎng)密度、攝食頻率和攝食水平對珍珠龍膽石斑魚 (Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂) 特定生長速率、餌料轉化率和胃蛋白酶活性的綜合影響[5]，黑鰭髭鯛 (Hapalogenys nigripinnis) 幼魚的最優(yōu)投喂頻率[6]，大白姑魚 (Argyrosomus japonicas) 幼魚最佳投喂頻率[7]等。

牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 隸屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，俗稱牙片、偏口、左鲆等[8]，是中國北方主要海水魚類養(yǎng)殖品種，目前以工廠化養(yǎng)殖為主。對投喂頻率的研究通常以飼料系數(shù)和特定生長率為指標[5]，但這兩個指標不能從本質上解釋投喂頻率對水產(chǎn)動物的影響。水產(chǎn)動物的特定生長率和飼料系數(shù)受腸道消化吸收能力的影響[9]，腸道結構的完整性和消化酶活性是影響腸道消化吸收能力的重要因素[10]，因而腸道結構的完整性和消化酶活性更能從本質上揭示水產(chǎn)動物對食物的消化吸收情況。投喂頻率通過影響大黃魚(Pseudosciaena crocea)胰蛋白酶活性進而能夠影響其生長率[3]，因此完整、健康的腸道是保證水產(chǎn)動物生長的重要基礎。

在牙鲆養(yǎng)殖過程中，疾病是影響成活率的一個重要因素。機體代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基 (·O2?) 可誘發(fā)一系列病變反應，如機體的抗氧化系統(tǒng)不能及時清除自由基，則會對機體造成嚴重的氧化損傷[11]。自然環(huán)境下，機體通過超氧化物歧化酶 (SOD) 與自由基間發(fā)生的歧化反應來清除自由基。SOD是一種廣泛存在于動植物、微生物中的金屬酶，能將生物體內轉化為氧氣 (O2) 和過氧化氫 (H2O2)，在生物體的自我保護系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要的作用。歧化反應產(chǎn)生的H2O2可穿透大部分細胞膜，比有更強的細胞毒性。過氧化氫酶 (CAT) 存在于所有已知動物的各個組織中，在肝臟中的濃度最高[12]。CAT的作用是促使H2O2分解為分子氧和水，使細胞免受H2O2的毒害，維護細胞的穩(wěn)定性和完整性，起到保護細胞的作用[13]。因此，本研究將SOD和CAT活性作為反映魚體健康程度的指標。

牙鲆在自然條件下的攝食規(guī)律已被充分研究，但在流水養(yǎng)殖條件下，其養(yǎng)成階段的最佳投喂頻率尚未確定。因此，本研究選擇1齡牙鲆為研究對象，探討了流水養(yǎng)殖條件下不同投喂頻率對牙鲆腸道組織結構和生理生化指標的影響，旨在從生理生化水平揭示投喂頻率對牙鲆生長的影響機制，為提升其養(yǎng)殖管理水平提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與飼料

實驗魚由煙臺市海陽市黃海水產(chǎn)有限公司提供。實驗開始前在馴養(yǎng)池馴養(yǎng)15 d，馴養(yǎng)期間每天投喂2次 (07:00和17:00)。待實驗魚狀態(tài)穩(wěn)定后，挑選健康魚360尾，平均體長 (31.21±0.81) cm、平均體質量 (308.71±7.61) g，隨機分配到9個養(yǎng)殖缸中，每缸40尾，停食1 d后開始實驗。

實驗用飼料為黃海水產(chǎn)有限公司飼料車間提供的自制軟顆粒飼料。具體加工方法：將冰鮮野雜魚粉碎，制成魚漿后混合魚粉、玉米粉，添加誘食劑、維生素、魚油等擠壓成型，于?20 °C冷庫中保存待用。

1.2 實驗系統(tǒng)與日常管理

本實驗于2019年9—11月在黃海水產(chǎn)有限公司進行。實驗用容器為9個半徑1.5 m、高1.2 m的圓形玻璃缸，實驗用水為天然海水，經(jīng)砂濾、沉淀處理后通過管道注入實驗缸。實驗期間連續(xù)24 h不間斷充氣，采用自然光。每天用YSI儀(556MPS)檢測水溫 [(22.31±2.31) °C]、鹽度(32.14±3.16)、溶解氧質量濃度 [(4.23±0.17) mg·L?1]和 pH (8.20±0.62)。

每次投喂0.5 h后徹底換水并清理糞便。實驗期間根據(jù)實驗缸內壁清潔程度清理附著其上的污物，并及時隔離病魚，清除死魚。

1.3 實驗方法

設置投喂頻率為每天2、3、4次3個實驗組，分別編號為T2、T3、T4，每組設置3個平行。鮑枳月等[14]研究發(fā)現(xiàn)晨昏時段是牙鲆的攝食高峰期，故將實驗時間段設置在06:00—18:00。T2組間隔12 h投喂1次，投喂時間分別為06:00和18:00；T3組間隔6 h投喂1次，投喂時間分別為06:00、12:00和18:00；T4組間隔4 h投喂1次，投喂時間分別為06:00、10:00、14:00和18:00。每次均為飽食投喂。

為了計算攝食量 (投喂量?殘餌量)，在實驗開始前對不同數(shù)量的飼料稱質量 (g)，并根據(jù)粒數(shù)與相應飼料質量建立回歸方程：y=0.283x?0.371,R2=0.981，y為殘餌質量 (g)，x為殘餌個數(shù)。實驗期間嚴格按照預先設計的投喂策略定時定點投喂飼料，并詳細記錄每次投喂量。

1.4 樣本采集與處理

每15 d記錄一次實驗魚的體長和體質量。從每個實驗缸中隨機抽取10尾魚，置于已稀釋的麻醉液中 [V(MS-222)∶V(水)=1∶30 000]，約 30 s后從麻醉液中取出，用毛巾擦干魚體表水分，用刻度尺測量體長，用電子天平 (樂祺電子天平，LQC12001，精度0.01 g) 稱質量。

實驗結束后，所有實驗組停食24 h。每缸隨機抽取3尾魚，麻醉擦干后平放于解剖盤中，用注射器從尾靜脈取血2 mL，不加抗凝劑，置4 °C冰箱中過夜后，用離心機 (賽洛捷克D3024R臺式離心機) 離心 10 min (4 °C、1 200 r·min?1) ，取上清液并迅速置于?80 °C冰箱保存，用于檢測CAT和總超氧化物歧化酶 (T-SOD)。采血后的解剖樣品魚，分離出胃、腸分別裝入密封袋并置于液氮中，然后轉移至?80 °C冰箱中保存；實驗結束后，將胃、腸解凍后，刮取胃中部和中腸黏液，用預冷后的生理鹽水稀釋至最佳檢測濃度。

每個實驗缸隨機取3尾魚解剖取出腸道，立即浸入4%多聚甲醛固定液中固定，送武漢塞維爾生物科技有限公司對中腸切片；將獲得的切片在光學顯微鏡 (WM-9950)下觀察，測量并統(tǒng)計腸道指標。

胃蛋白酶 (PPS)、總蛋白、脂肪酶 (LPS)、CAT和T-SOD均由南京建成生物工程研究所提供的相關試劑盒測定。

1.5 計算與統(tǒng)計分析

成活率 (Survival rate, SR, %)、增重率(Weight gain rate, WGR, %)、飼料系數(shù) (Feed conversion ratio, FCR, %)、攝食量 (Food consumption, FC, g) 和特定生長率 (Specific growth rate, SGR, %·d?1) 等生長指標的計算公式如下：

式中，Q為末期剩余魚數(shù) (尾)，M0為初始平均體質量 (g)，F(xiàn)Q為投喂量，M1為末期平均體質量 (g)，M2為實驗期間總攝食量(g)，d為總實驗天數(shù) (d)，x為殘餌粒數(shù) (個)。

數(shù)據(jù)采用OriginPro 2018、IBM SPSS Statistics 25.0 和Excel 2019軟件處理，結果以“平均值±標準差 ()”表示。結果經(jīng)單因素方差分析 (Oneway ANOVA)，若結果顯著，則進行鄧肯事后多重比較 (P＜0.05)，檢驗組間差異性。

2 結果

2.1 投喂頻率對牙鲆攝食量的影響

投喂頻率對牙鲆平均每尾日攝食量有顯著影響，T3組最大 [(8.06±1.47) g]，且與T2組[ (5.63±1.36) g]、T4 組 [(6.07±1.08) g]之間差異顯著 (P＜0.05)；T2與T4組之間差異不顯著 (表1，P＞0.05)。相同時間點下，不同實驗組中每尾魚的平均攝食量逐漸下降；06:00時，T3和T4組的攝食量分別為 (2.24±0.96) g和 (2.00±0.59) g，兩者無顯著差異，但均顯著低于 T2 組 [(2.94±0.91) g，P＜0.05)]；18:00 時，T2和T3組的攝食量分別為 (2.70±0.86) g和(2.36±0.82) g，兩者差異不顯著 (P＞0.05)，但均顯著高于T4 組 [(1.11±0.87) g,P＜0.05]。

表1 投喂頻率對牙鲆攝食量的影響Table 1 Effect of feeding frequency on feeding of P.olivaceus

2.2 投喂頻率對牙鲆生長指標的影響

T2和T3組的特定生長率分別為1.13 %·d?1和 1.17 %·d?1，顯著高于 T4 組 (P＜0.05)，T2 與T3組間無顯著差異 (P＜0.05)；T4組的飼料系數(shù)最大 (1.27%)，極顯著高于T2和 T3組 (P＜0.01)，T2和T3組間無顯著差異(P＞0.05)；T3、T2和T4組的增重率依次減小，分別為52.71%、45.37%和32.3%，且3組間差異顯著 [P＜0.05，其中T3和T4組間差異極顯著 (P＜0.01)]；T2和T3組的成活率分別為95%和94%，兩組間無顯著差異；T4組的成活率為80%，極顯著低于T2和T3組(P＜0.01，圖1)。

圖1 投喂頻率對牙鲆生長指標的影響*.5%的顯著性水平；**.1%的顯著性水平；后圖同此Figure 1 Effect of feeding frequency on growth of P.olivaceus SGR.Specific growth rate; FCR.Feed conversion ratio; WGR.Weight gain rate; SR.Survival rate;*.Significance level of 5%; **.Significance level of 1%.The same below.

2.3 投喂頻率對牙鲆消化酶和抗氧化酶活性的影響

3組間淀粉酶 (AMY) 活性無顯著性差異(P＞0.05)。T4 組的 LPS 活性為 8.52 U·mg?1，極顯著低于T2和T3組 (P＜0.01，圖2)；T2和T3組間無顯著差異(P＞0.05)。T4組的CAT活性為2.03 U·mg?1，極顯著低于 T2 和 T3 組 (P＜0.01)；T2 和T3組間無顯著差異(P＞0.05)。T3、T2和T4組的PPS活性依次減小，分別為37.76、34.72和27.73 U·mg?1，3 組間差異顯著 (P＜0.05)，其中 T3 與T4組間差異極顯著 (P＜0.01)。T4組的T-SOD活性為 118.58 U·mg?1，顯著低于 T2 和 T3 組 (P＜0.05)；T2和T3間無顯著差異 (P＞0.05)。

圖2 投喂頻率對牙鲆腸道消化酶和抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of feeding frequency on enzyme activity of intestinal digestive enzymes and immune-related enzymes of P.olivaceus

2.4 投喂頻率對牙鲆腸道組織形態(tài)的影響

牙鲆腸壁結構由內到外依次為黏膜層、黏膜下層、環(huán)肌層、縱肌層和漿膜層[15]。本實驗結果顯示，不同投喂頻率下的牙鲆腸道結構有差異。T4組的腸壁厚度 (IWT) 最小 (202.06 mm)，與T2和T3組間差異極顯著 (P＜0.01)；T2和T3組間差異不顯著 (P＞0.05)。T4組的環(huán)肌厚度 (LMT) 最小 (152.41 mm)，與 T2和T3組間差異極顯著 (P＜0.01)；T2和T3組間差異不顯著 (P＞0.05)。T3組的上皮細胞厚度 (ETC) 最大 (57.26 mm)，且與T2和T4組間有顯著差異 (P＜0.05)；T2和T4組間差異不顯著 (P＞0.05)。T2和T3組的杯狀細胞數(shù)(GC) 分別為28.83和31.86，兩組間無顯著差異，但都極顯著高于T4組 (P＜0.01，圖3)。

在40×顯微鏡下，T4組腸絨毛較T2和T3組稀疏，且高度參差不齊，出現(xiàn)斷裂，分叉少，數(shù)量明顯少于T2和T3組，且T4組腸絨毛上皮細胞不完整，出現(xiàn)缺刻；T2和T3組黏膜層更厚，腸絨毛數(shù)量豐富，排列緊密，分叉多，外側光滑完整無缺刻，充滿整個腸腔 (圖4-a, 4-c, 4-e)。在100×顯微鏡下，T4組環(huán)肌層與縱肌層間分界線不明顯，肌層明顯薄于其他組；T2和T3組環(huán)肌層與縱肌層的分界線較T4組明顯；T4組肌層和黏膜層間出現(xiàn)空隙 (圖4-b, 4-d, 4-f)。

圖4 不同投喂頻率下牙鲆腸道組織切片觀察a.T2 組 (40×)；b.T3 組 (40×)；c.T4 組 (40×)；d.T2 組 (100×)；e.T3 組 (100×)；f.T4 組 (100×)Figure 4 Histological observation of intestinal structure of P. olivaceus at different feeding frequenciesa.T2 group (40×); b.T3 group (40×); c.T4 group (40×); d.T2 group (100×);e.T3 group (100×); f.T4 group (100×); IW.Intestinal wall; CM.Circular muscle;LM.Longitudinal muscle; GC.Goblet cell

3 討論

3.1 投喂頻率對牙鲆成活率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，投喂頻率會影響大西洋鮭 (Salmo salar)[16]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[17-18]的成活率。本實驗結果也顯示投喂頻率影響了牙鲆的成活率。生物體自身的抗逆能力是影響其成活率的因素之一。生物體在代謝過程中會產(chǎn)生超氧自由基和H2O2，二者有毒害作用，若未被及時清除，會影響其對不利環(huán)境的抗逆能力[12-13]。T-SOD和CAT是生物體產(chǎn)生的、專門清除超氧自由基和H2O2的酶，若活性不足會影響其抗逆能力。本實驗結果顯示，T4組T-SOD和CAT活性顯著低于其他組，因此，較低的T-SOD和CAT活性是導致T4組成活率低的原因之一。

腸黏膜是腸腺和杯狀細胞等單細胞腺體生長的組織基礎，其完整性在一定程度上決定了腺體數(shù)量的多少，腸黏膜越完整，腺體數(shù)量則越多[19]。杯狀細胞是一種單細胞腺體，其分泌的黏液在腸壁內層形成黏膜以保護上皮細胞，杯狀細胞數(shù)量減少會破壞黏膜的完整性，導致腸道抵抗外源性刺激和致病菌入侵的能力降低；杯狀細胞數(shù)量越少，腸道受外源因素侵染的可能性就越大[20]。從牙鲆腸道的石蠟切片可以看出，T4組腸黏膜的完整性明顯不及其他組，杯狀細胞數(shù)量也顯著少于其他組。腸道結構不完整是腸道受侵染的結果，腸黏膜是免疫系統(tǒng)的第一道屏障，該屏障受到破壞后會影響成活率，T4組的低成活率也證實了這一點。

3.2 投喂頻率對牙鲆消化吸收的影響

不同攝食頻率對漠斑牙鲆 (P.lethostigma) 消化道組織結構有顯著影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)投喂頻率越高，對腸道結構和消化酶活性的影響越顯著。牙鲆消化道由口咽腔、食道、胃、幽門垂、小腸和直腸等構成[22]。腸壁和肌層起支撐腸道的作用，是腸道消化吸收的組織基礎，T4組的腸壁不如其他組厚，而較薄的腸壁會影響腸道的蠕動[22]。腸黏膜中含有大量腸腺，腸腺是一種能夠分泌腸液的腺體，腸液中含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等消化酶，因此消化酶活性可以反映腸腺數(shù)量的多少[23]。T4組的腸道脂肪酶活性顯著低于其他組，說明T4組腸黏膜中的腸腺數(shù)量不及其他組。消化道中的消化液除少量在腸腺中合成外，大部分由消化腺合成分泌。消化腺是消化系統(tǒng)中具有分泌消化液功能的腺體。胰腺、肝臟、胃腺和腸腺均可分泌消化液，消化液中含有胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶[22]。當投喂頻率每天超過3次時，牙鲆胃蛋白酶和脂肪酶活性受到抑制，但淀粉酶活性未受影響。魚類消化道中淀粉酶活性較低，投喂頻率對淀粉酶的影響不顯著。魚體中胰島素的分泌量不足、受體少，不能對糖代謝進行有效調控，因此相對于畜禽類，魚類對糖類的利用能力較差[24]。投喂頻率對不同水生動物的影響有差異，如投喂頻率會引起瓦氏黃顙魚(Pseudobagrus vachelli) 消化酶活性變化[25]，高投喂頻率使凡納濱對蝦的消化酶和抗氧化酶活性更高[26]，投喂頻率每天超過2次時條石鯛 (Oplegnathus fasciatus) 幼魚的消化酶活性受到抑制[27]。

腸道蠕動能力和消化酶活性會影響生物體對食物的消化吸收，蠕動能力強、消化酶活性高的生物對食物的消化吸收能力更強[22]。飼料系數(shù)反映了生物體對食物的轉化能力，T4組的高飼料系數(shù)和低攝食量也證明了不完整的腸道結構和低消化酶活性不利于牙鲆消化吸收食物中的營養(yǎng)物質。消化道是生物體從外界獲取營養(yǎng)物質的唯一途徑[28]，消化道受損，生物體無法獲取生長所需的營養(yǎng)物質，其生長將受到抑制。T4組的低特定生長率和低增重率也證明了這一點。當投喂頻率增加到3次·d?1時，實驗魚的攝食量顯著增加，但投喂頻率對該組魚的腸道結構和消化酶活性無顯著影響，因此相對于T2組，T3組增加的飼料能夠被消化吸收。由于T3組吸收了更多的營養(yǎng)物質，故其增重率顯著高于T2組。本實驗顯示，投喂頻率為3 次·d?1時，日攝食量最大。這一結果與Lee等[29]、鮑枳月等[14]和林利民等[30]的研究結果有差異，可能由實驗方法和實驗魚規(guī)格不同所致，后者研究的是牙鲆仔、稚、幼魚，實驗方法未考慮投喂頻率，而本實驗使用平均體質量為308.71 g的成年魚，實驗變量即為投喂頻率。

魚類對營養(yǎng)物質的消化和吸收是其生長發(fā)育的基礎，而消化和吸收主要依靠消化系統(tǒng)完成[31]。消化系統(tǒng)由消化道和消化腺兩部分組成。消化酶活性和消化道結構的完整性在一定程度上決定了水生動物對食物的消化吸收能力，消化酶活性高、消化道結構完整的生物對食物有更高的吸收率，營養(yǎng)物質的積累速度更快，因此攝食量也更大。

4 結論

合適的投喂頻率有助于提高飼料利用率、降低飼料系數(shù)，但投喂頻率過高不利于飼料的轉化，且未被攝入的飼料溶解到養(yǎng)殖水體中，會造成水質惡化，從而降低養(yǎng)殖動物的成活率。綜上所述，每天投喂2～3次時牙鲆有較高的特定生長率和成活率、較低的飼料系數(shù)，但綜合考慮增重率，投喂頻率為3次·d?1時，牙鲆對營養(yǎng)物質的吸收和增重率達到最大。建議每天在06:00、12:00和18:00共3個時間點投喂3次，日投喂量為體質量的1.9%。