陳繼美，陳 奮

(1.廣西貴港市桂平市石龍鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 桂平 537200；2.桂平市金田鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 桂平 537200)

0 引言

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種真菌毒素，會在適應(yīng)的環(huán)境條件下產(chǎn)生，它又被稱為F-2毒素，可以由多種菌種轉(zhuǎn)變而成，常見的菌種有尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等，具有與雌激素相似的作用，可以造成生殖毒性和致畸。通過檢測雞飼料及原料是否含有玉米赤霉烯酮的方式來監(jiān)控飼料的污染情況。

1 檢測材料及方法

1.1 材料與試劑制作

本次研究使用免疫親和柱、色譜純、甲醇、乙腈等材料，親和柱選用的是helix玉米赤霉烯酮免疫親和柱，并選用10 mg的玉米赤霉烯酮進行實驗。在分析提出方面采用廣州市廣聯(lián)津化工有限公司的去離子水、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等物品。

試劑制作的步驟：明確試劑提取標(biāo)準(zhǔn)，試劑提取標(biāo)準(zhǔn)為乙腈與水的比例為9:1。制作磷酸鹽緩沖液，制作標(biāo)準(zhǔn)為pH 7.4(50 mm PBS)，需要使用磷酸氫二鉀7.27 g、磷酸二氫鉀1.24 g、氯化鈉8.76 g進行溶解，離子水的含量為1L。

1.2 儀器與設(shè)備

設(shè)備儀器采用的是美國Agilent公司出品的熒光檢測器和Agilent1260高效液相色譜儀。同時使用空氣壓力泵、超聲振蕩儀、SPE固相萃取裝置、渦旋混合器、離心機等設(shè)備儀器[3]。

1.3 檢測方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制需要采用玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物和甲醇2種材料，然后準(zhǔn)確稱取適量的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物并與甲醇進行溶解，配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度保持在100.0 μg/mL(參考資料數(shù)據(jù))，再用超純水分別配成5份濃度不同的工作溶液，濃度分別是10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L、500 μg/L，等待測量。

1.3.2 制備與提取試樣

精準(zhǔn)稱取20 g樣品，將其進行粉碎，放入100 mL的離心管中，在離心管中加入50 mL提取液，通過渦旋混合器攪拌均勻，攪拌時間為1 min，將攪拌好的試劑放入超聲波清洗器內(nèi)30 min，在過程中對試劑震蕩2～3次，每次速度為10 000 r/min離心，持續(xù)時間5 min，然后倒入試管進行備用。接著取出其1 mL，在清液中加入9 mL磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻。

1.3.3 樣品凈化

將免疫親和柱放置在玻璃注射器下，然后取出10 mL的試樣放入玻璃注射器中。通過調(diào)節(jié)壓力方式讓試樣慢慢經(jīng)過玻璃注射器，使清液流入免疫親和柱中，注意控制清液流速在1滴/s。待清液完全進入親和柱后，再用20 mL去離子水淋洗免疫親和柱，速度為1～2滴/s，當(dāng)液體全部進入親和柱后抽干玻璃注射器的液體和空氣。

1.3.4 洗脫

洗脫需要在免疫親和柱中進行。具體方式:先加入0.5 mL甲醇，待30 s后，再加入0.5 mL，然后收集洗脫液，并使用0.22～0.45μm有機濾膜進行過濾，并將過濾得出的液體放入機器。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜柱需要保持柱溫為30℃，采用的是C18柱色譜柱。流動相采用比例為75:25的甲醇水，保持流速為1.0 mL/min。檢測波長的條件是發(fā)射波長440 nm，激發(fā)波長274 nm。

1.3.6 測定樣品

在提取出雞飼料與原料中的樣品后，使用液相色譜分析法分析樣品的具體成分，將樣品放入提取液中進行測量，進樣量為100.0 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化色譜條件

玉米赤霉烯酮可以發(fā)出熒光，且顏色為藍(lán)綠色，可以通過熒光檢測器進行檢測。而且，根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激發(fā)波長為274 nm、射波長為440 nm時，最容易將米赤霉烯酮檢測出來。本次實驗采用的是C18柱反相色譜柱，使用甲醇‐水作為流動相，并且保持流速為1.0 mL/min。因此，根據(jù)實驗條件可以得出玉米赤霉烯酮的色譜峰，保留時間長達(dá)7.5 min，實驗條件能夠滿足檢測需求。

2.2 雞飼料中玉米赤霉烯酮的分布情況

在5種118批雞飼料中檢測，結(jié)果如表1所示。玉米赤霉烯酮在118批雞飼料的檢測結(jié)果為30.51%，超出標(biāo)準(zhǔn)量5.08%。大雞料的檢測結(jié)果為167.78 μg/kg，屬檢測結(jié)果最大值，蛋雞料檢測結(jié)果為28.18 μg/kg，屬檢測結(jié)果最小值。

表1 雞飼料中玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果

3 結(jié)語

通過高效液相色譜-熒光檢測方法可以快速檢測出飼料及原料中玉米赤霉烯酮的含量，是一種高效的檢測方法。