傅蕾 保志軍 茍海昕

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200040;2上海市老年醫(yī)學(xué)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院傷外科)

隨著生命科學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組時(shí)代，人類對(duì)疾病狀態(tài)分子機(jī)制的不斷研究，疾病診斷和治療由傳統(tǒng)的疾病治療模式進(jìn)入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)模式。規(guī)范化的老年病樣本庫(kù)建設(shè)和管理，提供高質(zhì)量的樣本和完整臨床信息服務(wù)是老年醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。作為質(zhì)量管理體系中重要的組成部分，安全管理體系的建設(shè)和完善是樣本質(zhì)量的最基本保證。生物樣本庫(kù)生物安全日益受到重視，為確保老年病樣本庫(kù)在生物安全前提下正常運(yùn)行，本文旨在探討老年病樣本庫(kù)安全管理體系的建立和優(yōu)化，工作流程的規(guī)范化管理，個(gè)人和樣本存儲(chǔ)環(huán)境的生物安全措施。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 生物樣本庫(kù)以老年病的防治、抗衰老研究為主要方向,樣本均來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院各臨床科室住院和門診≥60歲患者及體檢人群。

1.2研究方法 專職人員培訓(xùn)樣本庫(kù)有專職人員管理。按照《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB 19489-2008)中的實(shí)驗(yàn)室人員管理要求對(duì)樣本庫(kù)人員在實(shí)驗(yàn)室管理體系、安全知識(shí)及技能、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備(包括個(gè)體防護(hù)裝備)的安全使用和我院樣本庫(kù)設(shè)立的工作流程等方面組織培訓(xùn)，考核合格后上崗。樣本庫(kù)基礎(chǔ)建設(shè)進(jìn)行生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)參照《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》(WS233-2002)中的“實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平分級(jí)與分類”，根據(jù)我院樣本庫(kù)基礎(chǔ)建設(shè)條件、處理樣本的類型和操作流程等，老年病樣本庫(kù)按照生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室(BSL-2)建設(shè)〔1,2〕。樣本庫(kù)布局做到：①生物安全分區(qū)。按照生物安全的防護(hù)要求，老年病樣本庫(kù)的場(chǎng)地進(jìn)行生物安全的分區(qū)設(shè)置，樣本庫(kù)內(nèi)設(shè)置4～80℃預(yù)入庫(kù)區(qū)。接收處理的樣本統(tǒng)一放置臨時(shí)存儲(chǔ)區(qū)做預(yù)入庫(kù)。設(shè)置清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)。清潔區(qū)包括辦公室和耗材存儲(chǔ)室；半污染區(qū)包括常溫和低溫樣本存儲(chǔ)室、超低溫樣本存儲(chǔ)室；污染區(qū)包括樣本接收區(qū)、樣本處理區(qū)、污物處理間和質(zhì)控室。各區(qū)貼醒目的標(biāo)識(shí)。②人流和物流分開(kāi)，人流從清潔區(qū)進(jìn)入，物流(樣本流)從污染區(qū)進(jìn)入。在物流入口粘貼“生物污染”標(biāo)識(shí)。

1.3建立和優(yōu)化安全管理體系 根據(jù)中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)(試行) 和國(guó)際生物和環(huán)境樣本庫(kù)協(xié)會(huì)(ISBER) 出版的(Best Practices for Repositories) 國(guó)際公認(rèn)的樣本庫(kù)管理規(guī)范，建立老年病樣本庫(kù)的質(zhì)量管理控制體系文件，編制質(zhì)量手冊(cè)，包含 QA/QC 的所有流程。優(yōu)化其中的安全管理體系文件，包括人員安全、設(shè)施及設(shè)備維護(hù)、樣本安全、意外事故應(yīng)急處理方案等方面內(nèi)容。

1.3.1建立樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程 從樣本的收集、運(yùn)輸、處理、存儲(chǔ)、使用等方面全程進(jìn)行質(zhì)量控制。樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化流程見(jiàn)圖1。

1.3.2樣本采集 取樣人員需佩戴外科口罩或N95口罩、工作服、乳膠手套等防護(hù)用品。采樣前打印二維碼貼好采樣管和樣本采集表。采樣后樣本采集管外壁和轉(zhuǎn)運(yùn)箱噴灑消毒液。在樣品采集方面主要遵循以下幾點(diǎn)〔3〕：①嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的采樣程序；②收集足夠量的生物材料以滿足所有檢測(cè)的需求；③對(duì)樣本進(jìn)行嚴(yán)格標(biāo)識(shí)，標(biāo)識(shí)內(nèi)容包括來(lái)源病人的姓名、編號(hào)、標(biāo)本來(lái)源、采集時(shí)間及采集人員的姓名等信息。

圖1 樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化流程

1.3.3樣本運(yùn)輸和接收 轉(zhuǎn)運(yùn)人員按一級(jí)生物安全防護(hù)要求著裝，將消毒后空轉(zhuǎn)運(yùn)設(shè)備置于取樣處臨時(shí)存放點(diǎn)，收集裝有標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)噴灑2 000 mg/L含氯消毒液后加蓋密封與采樣人員交接，填寫樣本交接記錄。運(yùn)輸過(guò)程中容器保持瓶口向上，保持設(shè)備平穩(wěn)，避免劇烈振蕩顛簸、產(chǎn)生氣溶膠或劇烈震動(dòng)導(dǎo)致標(biāo)本溶血。轉(zhuǎn)運(yùn)途中不要自行打開(kāi)轉(zhuǎn)運(yùn)箱，如有意外發(fā)生，到樣本庫(kù)接收點(diǎn)與樣本庫(kù)工作人員共同處理。社區(qū)流調(diào)樣本長(zhǎng)距離運(yùn)輸，需用生物樣本運(yùn)輸專用車輛。為保持樣本活性,樣本采集后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)運(yùn)至樣本保藏中心處理、凍存。若需要長(zhǎng)途運(yùn)輸無(wú)法在24 h內(nèi)送達(dá)如跨省轉(zhuǎn)運(yùn)樣本，保持在4～8℃。組織樣本迅速分割成適當(dāng)大小和份數(shù)，加入適當(dāng)?shù)臉颖颈Ｗo(hù)液或直接放入液氮中快速冷凍保存。樣本接收時(shí)，工作人員按照一級(jí)生物安全防護(hù)要求著裝，樣本接收時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)箱包表面用75%酒精進(jìn)行擦拭消毒后直接放置于4℃ 冰箱，將紙質(zhì)樣本采集表、知情同意書(shū)、放入生物安全柜中進(jìn)行紫外燈照射30 min。同時(shí)核對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)清單,樣本采集表、知情同意書(shū) 標(biāo)簽信息包括每一例患者流行病學(xué)史、姓名、登記號(hào)、采集時(shí)間等信息是否完整并簽字,以便回溯。樣本運(yùn)輸人員領(lǐng)取已消毒后的運(yùn)輸包用于再次運(yùn)輸樣本。

1.4樣本處理 樣本處理和預(yù)入庫(kù)進(jìn)入樣本庫(kù)污染區(qū)做好基本防護(hù)工作，包括穿隔離衣或防護(hù)服，佩戴護(hù)目鏡、手套、口罩、帽子及鞋套。對(duì)于無(wú)需開(kāi)蓋二次處理的樣本在安全柜中消毒采樣管外壁后由入庫(kù)員標(biāo)記，放入臨時(shí)存儲(chǔ)區(qū)-80℃隔離冰箱做預(yù)入庫(kù)。對(duì)于需要分裝和二次處理的樣本改為二級(jí)生物安全防護(hù)〔4〕,離心后的樣本管在生物安全柜中打開(kāi)管帽處理、分裝入已貼二維碼凍存管，管外表面用75%酒精消毒擦拭后放入凍存盒內(nèi)，凍存盒表面消毒后由入庫(kù)員二維碼掃描并在樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)中做預(yù)入庫(kù)，放入臨時(shí)存儲(chǔ)區(qū)。使用超低溫冰箱和液氮罐時(shí)，需佩戴防低溫手套。特別在操作液氮罐時(shí)，還需佩戴面罩或眼罩，防止液氮飛濺至臉部或眼睛。

1.5樣本數(shù)據(jù)錄入和入庫(kù) 老年病樣本庫(kù)對(duì)患者基本信息、流行病學(xué)史、病史、治療、隨訪資料完整錄入樣本數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)詳細(xì)錄入樣本類型、位置、編碼及從采集到存儲(chǔ)入庫(kù)的分析前變量(SPREC)〔5〕。在隨訪記錄中設(shè)置預(yù)入庫(kù)15 d后隨訪提醒，預(yù)入庫(kù)30 d后如無(wú)隨訪信息，作為失訪樣本銷毀處理。隨訪患者確定無(wú)高致病原微生物感染情況下樣本入庫(kù)轉(zhuǎn)入存儲(chǔ)區(qū)。

1.6樣本庫(kù)樣本共享和轉(zhuǎn)運(yùn)安全 對(duì)樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)設(shè)置訪問(wèn)權(quán)限，定期數(shù)據(jù)異地備份并定期進(jìn)行數(shù)據(jù)維護(hù)以保證樣本庫(kù)數(shù)據(jù)安全。開(kāi)放樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)的數(shù)據(jù)接口，和醫(yī)院信息管理系統(tǒng)連接，參與復(fù)旦大學(xué)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)化樣本庫(kù)信息管理平臺(tái)建設(shè)，使樣本庫(kù)信息可被統(tǒng)一采集共享。樣本出庫(kù)時(shí)需簽署共享使用協(xié)議書(shū)后，方可執(zhí)行樣本及數(shù)據(jù)出庫(kù)〔6〕。樣本出庫(kù)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)使用干冰或運(yùn)輸液氮罐。樣本數(shù)據(jù)需去除姓名、性別、身份證號(hào)碼、醫(yī)?？ㄌ?hào)等個(gè)人信息，保護(hù)患者隱私。盡量避免樣本庫(kù)數(shù)據(jù)存放到移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備，如需使用移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加密處理，防止移動(dòng)設(shè)備丟失后造成的倫理風(fēng)險(xiǎn)。

1.7建立應(yīng)急預(yù)案 對(duì)樣本容器破裂、操作環(huán)境污染(生物安全柜內(nèi)溢灑、離心機(jī)內(nèi)溢灑等)及防護(hù)設(shè)備異常(如護(hù)目鏡起霧、防護(hù)設(shè)備松脫、手套破損及被液體樣本噴濺等)的突發(fā)情況參照實(shí)驗(yàn)室生物危險(xiǎn)物質(zhì)溢灑處理指南〔4〕制定應(yīng)急預(yù)案。同時(shí)制定超低溫冰箱應(yīng)急處置預(yù)案，最大程度降低樣本庫(kù)安全風(fēng)險(xiǎn)。制定火災(zāi)、水災(zāi)、冰凍、地震、人為破壞等任何意外緊急情況下的應(yīng)急預(yù)案，每年至少組織所有實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行一次演習(xí)。

1.8建立樣本庫(kù)消毒制度 空氣消毒：室內(nèi)自然通風(fēng)，室內(nèi)紫外燈照射每天2次，每次不少于30 min。根據(jù)消毒空間大小合理應(yīng)用紫外線燈管數(shù)量及有效消毒距離。物體表面及地面消毒：每日中午和下班前使用1 000 mg/L含氯消毒液對(duì)地面、操作臺(tái)、儀器、門把手消毒，做好日常消毒記錄,若有污染物先用消毒濕紙巾除去再用2 000 mg/L含氯消毒液〔7〕。 生物安全操作柜和轉(zhuǎn)運(yùn)箱消毒：二級(jí)生物安全柜操作空間每次使用前后用75%乙醇消毒,消毒后開(kāi)啟紫外燈照射消毒30 min。轉(zhuǎn)運(yùn)箱定期內(nèi)部和外部清潔消毒(采用有效氯濃度為500 mg/L 的消毒液或75% 乙醇)。實(shí)驗(yàn)室人員消毒：工作人員操作所有標(biāo)本后進(jìn)行手衛(wèi)生消毒,所有個(gè)人防護(hù)用具原則上一次性使用不再回收，如需要重復(fù)回收使用的污染物品(護(hù)目鏡、隔離衣等)，用1 000 mg/L含氯消毒劑浸泡作用30 min〔8〕。

1.9醫(yī)療廢物處置 按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》管理，患者所有標(biāo)本當(dāng)視為感染性醫(yī)療廢物,醫(yī)療廢物棄置于雙層醫(yī)療廢物包裝袋內(nèi)，雙層封扎，用1 000 mg/L含氯消毒液噴灑袋外表面,從污物流通道轉(zhuǎn)交，由醫(yī)院統(tǒng)一處理。

2 結(jié) 果

2.1樣本的收集情況 自2013年建庫(kù)以來(lái)，入庫(kù)病例共7 609例，血清、血漿、血細(xì)胞、核酸、總蛋白、新鮮冰凍組織和石蠟組織等類型樣本共6萬(wàn)多份，入庫(kù)病種主要為少肌癥、老年冠心病、老年高血壓、老年糖尿病、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、白塞病、帕金森病、阿爾茨海默病、脂肪肝等16個(gè)病種。約15 700份樣本已出庫(kù)用于臨床研究，樣本庫(kù)樣本使用率在26%左右。

2.2樣本的質(zhì)量鑒定 按0.1%比例隨機(jī)抽取76例樣本，進(jìn)行DNA和RNA檢測(cè)，結(jié)果顯示質(zhì)檢樣本取材準(zhǔn)確率在95%以上，DNA樣本OD260/OD280值為1.7～1.9；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有DNA完整性良好，無(wú)降解。RNA樣本A260/280值均為1.9～2.0。 RNA經(jīng)非變性電泳后，可見(jiàn)清晰的28 S和18 S條帶，且28 S/18 S在1.8 ～2.0 范圍內(nèi)，說(shuō)明RNA完整性較好，保存良好，樣本質(zhì)量穩(wěn)定，可以滿足老年病研究工作。

2.3老年病樣本庫(kù) 樣本庫(kù)在樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、處理、保藏等工作流程中加入生物安全防護(hù)措施。建立和完善了安全管理體系文件，制定安全培訓(xùn)計(jì)劃，對(duì)樣本庫(kù)工作人員進(jìn)行安全培訓(xùn)，落實(shí)樣本庫(kù)生物安全監(jiān)督管理措施。我院老年病樣本庫(kù)在樣本收集、處理過(guò)程中對(duì)重要參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)記錄，規(guī)范地給每份樣本附上分析前因素，對(duì)樣本的質(zhì)量進(jìn)行追溯。保證了樣本庫(kù)生物的安全和老年病樣本庫(kù)的樣本質(zhì)量。

3 討 論

樣本庫(kù)生物安全管理和安全管理體系的建立，對(duì)確保實(shí)驗(yàn)室工作人員、公眾、樣本和環(huán)境安全十分重要。2003 年以來(lái)，國(guó)家逐漸重視生物安全，相繼頒發(fā)了《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》等一系列法規(guī)，標(biāo)志著我國(guó)樣本庫(kù)生物安全管理步入科學(xué)、規(guī)范發(fā)展階段。但由中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì)(BBCMBA)開(kāi)展的生物樣本庫(kù)質(zhì)量達(dá)標(biāo)檢查中發(fā)現(xiàn)了我國(guó)生物樣本庫(kù)現(xiàn)存的一些安全管理問(wèn)題，如部分樣本庫(kù)場(chǎng)地規(guī)劃不分區(qū)、防護(hù)設(shè)施不完善、標(biāo)識(shí)不健全等、生物安全制度不健全。樣本采集與處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)不符合樣本庫(kù)實(shí)際需求，操作與SOP 不一致，無(wú)異常情況應(yīng)急預(yù)案等問(wèn)題。

樣本庫(kù)是采集和存儲(chǔ)樣本、樣本臨床和生物學(xué)信息一體化的重要基礎(chǔ)研究共享平臺(tái)。樣本質(zhì)量是生物樣本庫(kù)的核心，只有建設(shè)和完善質(zhì)量管理體系中安全管理體系，優(yōu)化樣本庫(kù)生物安全管理，提升樣本庫(kù)質(zhì)量和自身能力，才能從根本上保障樣本質(zhì)量。

我院老年病樣本庫(kù)成立生物安全管理委員會(huì)，專門負(fù)責(zé)制定生物安全方案和監(jiān)督其實(shí)施情況，包括樣本的采集、處理、信息錄入、樣本存儲(chǔ)和銷毀等環(huán)節(jié)中生物安全防護(hù)措施和操作規(guī)范。建立和優(yōu)化生物安全管理體系文件，制定應(yīng)急預(yù)案。樣本庫(kù)工作人員進(jìn)行規(guī)范化安全培訓(xùn)。在實(shí)施過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，進(jìn)行新的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，采取糾正措施，及時(shí)改進(jìn)識(shí)別，根據(jù)研究者反饋將改進(jìn)措施加入生物安全管理文件。特別在樣本入庫(kù)時(shí)，使用SPREC〔5〕記錄樣本分析前的操作處理各環(huán)節(jié)信息，包括樣本來(lái)源和樣本跟蹤信息等重要參數(shù)。在質(zhì)量管理體系中加入SPREC當(dāng)樣本出庫(kù)使用或樣本共享研究時(shí)，研究者可明確獲得每份樣本附上的分析前因素，從而有效追溯和評(píng)估SPREC對(duì)樣本分子水平的影響，及對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,有效保證了樣本的質(zhì)量穩(wěn)定。

老年病研究需要大樣本量，單一醫(yī)院的樣本庫(kù)無(wú)法完成樣本收集。但目前我國(guó)老年醫(yī)學(xué)研究生物樣本庫(kù)分散、樣本庫(kù)本身的質(zhì)量不高，加之沒(méi)有按統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范建庫(kù)，使得樣本資源難以共享。只有按統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范建立老年病樣本庫(kù)，建立和完善生物安全管理體系，科學(xué)管理，定期重新評(píng)估和升級(jí)修訂生物安全方案并加以監(jiān)督和實(shí)施，才能確保老年病樣本庫(kù)的生物安全。在保證樣本和數(shù)據(jù)安全的前提下，才能提供高質(zhì)量的共享樣本資源，在盤活樣本庫(kù)現(xiàn)有存量，提高樣本使用率的同時(shí)，能更好地推動(dòng)老年醫(yī)學(xué)及老年病研究發(fā)展和老年病樣本庫(kù)長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展。