石珊珊 劉麗潔 張秀娣 王曉杰 劉楠楠 尹小波 田祺 徐淑鳳

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000)

隨著城市大氣污染逐漸加重及其他各類致癌物質(zhì)不斷增加，肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率也隨之升高〔1〕。死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)是人體細(xì)胞中存在的抑癌因子之一，參與調(diào)節(jié)人類細(xì)胞的內(nèi)源性及外源性的凋亡途徑，DAPK基因啟動(dòng)子甲基化與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系〔2〕。研究結(jié)果表明，4%的組織特異性基因和所有的管家基因的5′端調(diào)控區(qū)都存在一個(gè)胞嘧啶磷酸鳥嘌呤(CpG)高頻區(qū)，稱為CpG島〔3〕。依據(jù)肺癌所具有的病理組織學(xué)特點(diǎn)可將其劃分為兩大類型即小細(xì)胞肺癌(SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，在臨床中80%～85%的肺癌患者的病理類型是NSCLC。目前研究遺傳學(xué)機(jī)制在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，尤其是T-鈣黏蛋白(CDH13)基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)與該基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程受抑制失活在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制〔4〕。抑癌基因的5′端CpG島甲基化在NSCLC發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)生比較頻繁，并且這種異常的甲基化狀態(tài)在肺癌發(fā)生的早期就能被檢測(cè)到。研究結(jié)果顯示，基因啟動(dòng)子的CpG島發(fā)生甲基化改變是引起基因失活特別是抑癌基因失活的關(guān)鍵因素之一，因此啟動(dòng)子甲基化改變?cè)贜SCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的作用也引起了廣泛的關(guān)注〔5〕。本研究探討吸煙肺鱗癌患者痰液及血清中DAPK表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化在臨床診療中的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取秦皇島第一醫(yī)院的肺鱗癌患者60例為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡(61.0±5.1)歲，同期健康人群34例為對(duì)照組，并均排除家族惡性腫瘤史，其中男20例，女14例，平均年齡(60.0±1.2)歲。兩組均留取其痰液及血清標(biāo)本。兩組性別、年齡等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，恒溫水箱(上海啟前公司)，水平凝膠電泳系統(tǒng)(英國(guó)Cleayer公司)，紫外分光光度計(jì)(上海光譜公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(北京東勝)，紫外熒光數(shù)字成像儀(德國(guó)孚光公司)，電子分析天平(日本島津公司)。兔抗人DAPK多克隆抗體(武漢博士德公司)，兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)多克隆抗體(北京中杉金橋)，2×Taq PCR MasterMix試劑盒(南京賽泓瑞公司)。采用引物為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，β-actin上游：5′-GGGACCTGACTGACCTCA-3′，下游：5′-GGTGGAATCCC TCCGACA-3′;DAPK上游：5′-GGATATGGGATTTTTGTGTAGATTAGTA-3′，下游：5′-ACCAAAATAATCTCCATCTCTTAAC-3′。

1.3痰液和血清脫氧核糖核酸(DNA)提取及甲基化檢測(cè) 試劑盒提取血清中DNA，血清中DNA甲基化檢測(cè)參照Hennan方法(MSP)。β-actin作為空白對(duì)照，健康人群DNA作為未甲基化分析的對(duì)照組。痰液留取及啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，患者入院后留取清晨口腔清潔后深咳痰液，置于Saccomanno液中，放置3 d。痰液中DNA的提取方法：4 000 r/min 4℃離心15 min后，將沉淀用DNA提取液〔10 mmol/L Tris·HCl；0.1 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，20 μg/ml核糖核酸(RNA)酶，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)〕移入1.5 ml離心管，混勻后37℃水浴1 h。以后步驟同血清標(biāo)本DNA提取及甲基化檢測(cè)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含EB)電泳(120 V，30 min)，內(nèi)參照為β-actin。應(yīng)用紫外線透視儀對(duì)相應(yīng)擴(kuò)增條帶進(jìn)行光密度值(IOD)測(cè)定。

1.4血清及痰液免疫組化 將采集后的血液及痰液進(jìn)行標(biāo)本處理，按常規(guī)免疫組化步驟行染色處理，DAPK表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，①按照高倍視野下所見(jiàn)組織著色程度(A值)進(jìn)行評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②按照高倍視野下所見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞百分率(B值)進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞小于25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞在25%～50%之間為2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%為3分；③將A值、B值相加對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷：陰性(-)：0分，弱陽(yáng)性(+)：1～3分，強(qiáng)陽(yáng)性()：4～6分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組痰液及血清中DAPK蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組痰液〔50.00%(+8例、15例、7例)〕及血清中DAPK蛋白表達(dá)陽(yáng)性率〔60.00%(+8例、20例、8例〕均顯著低于對(duì)照組〔91.18%(+4例、9例、8例)；91.18%(+2例、25例、48例)，χ2=16.151,10.303;均P<0.05〕。

2.2兩組痰液及血清中DAPK啟動(dòng)子甲基化率 實(shí)驗(yàn)組痰液及血清中DAPK啟動(dòng)子甲基化率〔37例(61.67%)、40例(66.67%)〕均顯著高于對(duì)照組〔0例(0.00%)、0例(0.00%)，均P<0.05〕。

2.3DAPK 在肺鱗癌患者痰液及血清中的表達(dá) DAPK在痰液和血清中表達(dá)量與年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 DAPK 在肺鱗癌患者痰液及血清中的表達(dá)〔n(%)〕

3 討 論

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化的發(fā)生和基因轉(zhuǎn)錄抑制失活緊密相關(guān)。在多種惡性腫瘤發(fā)生的早期過(guò)程中，基因啟動(dòng)子異常甲基化是一個(gè)頻繁發(fā)作的事件，因此研究者考慮它可作為一種有實(shí)際應(yīng)用可能的腫瘤分子生物標(biāo)志物〔6〕。近年來(lái)，研究者不斷地深入研究DNA 甲基化及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制?；蚪M通常含有兩類遺傳信息：由DNA序列提供的遺傳信息及提供了基因表達(dá)模式的表觀遺傳學(xué)信息。表觀遺傳信息主要的作用機(jī)制是DNA甲基化和(或)組蛋白乙?；?〕。在表觀遺傳學(xué)中，研究最廣泛、最深入的領(lǐng)域就是DNA甲基化。在絕大多數(shù)的真核生物遺傳物質(zhì)中，DNA甲基化過(guò)程被認(rèn)為只會(huì)發(fā)生在胞嘧啶的第五位碳原子上，S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)為DNA甲基化過(guò)程提供甲基(-CH3)，經(jīng)過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化后，SAM的甲基被轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第五位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)〔8〕。有研究表明人類基因啟動(dòng)子區(qū)約60%都含有CpG島，一旦CpG島發(fā)生甲基化，相應(yīng)的染色體結(jié)構(gòu)便會(huì)發(fā)生如高度螺旋、凝縮成團(tuán)、失去轉(zhuǎn)錄活性等變化，使基因不能正常表達(dá)。DNA甲基化可使染色體結(jié)構(gòu)修飾、基因組印跡、染色體失活等過(guò)程受到影響〔9〕。目前多種惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的不敏感甚至產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象已經(jīng)成為惡性腫瘤化療過(guò)程的一大障礙?；熕幬锸箰盒阅[瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的過(guò)程離不開(kāi)DNA修復(fù)基因的調(diào)節(jié)作用，若修復(fù)基因的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生DNA甲基化，將會(huì)導(dǎo)致基因不能正常轉(zhuǎn)錄從而引起基因沉默最終使修復(fù)基因不能正常表達(dá)〔10〕。在惡性腫瘤組織細(xì)胞中，可通過(guò)調(diào)節(jié)與DNA修復(fù)過(guò)程相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，最終誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞獲得對(duì)化療藥物固有性耐藥的特性；且化療藥物本身就能刺激腫瘤細(xì)胞的藥敏基因，引起藥敏基因DNA甲基化狀態(tài)的變化，從而誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥特性的產(chǎn)生。

研究者還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化具有可逆性特征，存在耐藥性基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生變化進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性發(fā)生變化的可能〔11〕。如DNA修復(fù)相關(guān)基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)。MGMT是一種可逆轉(zhuǎn)由烷化劑引起的DNA損傷的DNA修復(fù)酶。故其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類化療藥物作用的敏感性，這是惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的分子基礎(chǔ)。在惡性腫瘤細(xì)胞和組織中，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)改變是導(dǎo)致其活性降低的主要因素〔12〕。MGMT啟動(dòng)子CpG島的甲基化使轉(zhuǎn)錄不能正常進(jìn)行，進(jìn)而影響該基因正常表達(dá)而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致基因沉默。研究者已在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)這種機(jī)制進(jìn)行了大量研究〔13〕。MGMT基因啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)和惡性腫瘤組織細(xì)胞對(duì)烷化劑類藥物敏感性升高緊密相關(guān)，但MGMT甲基化水平與惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性之間并無(wú)明顯的相關(guān)性。冷曙光〔14〕對(duì)26株惡性黑色素瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞系之間對(duì)替莫唑胺的敏感性并不相同，MGMT的活性和表達(dá)水平與惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系；但對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果顯示，在26株細(xì)胞系中，11株細(xì)胞系基因并沒(méi)有發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)甲基化，15株細(xì)胞系基因既有啟動(dòng)子區(qū)甲基化又有未甲基化存在。提示MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺敏感性并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，表明在部分腫瘤細(xì)胞中，DNA甲基化改變并不是唯一能夠調(diào)節(jié)MGMT表達(dá)或活性的因素，也許存在其他影響因素，如單核苷酸多態(tài)性等可能也參與了MGMT的活性和表達(dá)，但具體機(jī)制仍需更深入研究與探討。

DAPK基因位于人類第9號(hào)常染色體q34.1上，其參與編碼翻譯的蛋白質(zhì)是一種依賴于鈣離子/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)、相對(duì)分子質(zhì)量為16×104的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的正調(diào)控因子。在人體的正常組織中，DAPK基因可通過(guò)多條途徑參與細(xì)胞凋亡，研究證實(shí)，DAPK可通過(guò)依賴P19arf方式激活p53從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；DAPK還可通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)、成人T淋巴細(xì)胞白血病PMA反應(yīng)基因(Noxa)和凋亡酶激活因子(Apaf)-1等觸發(fā)線粒體凋亡途徑的發(fā)生。在缺乏p53的細(xì)胞中，DAPK也可觸發(fā)Ⅱ型自噬性細(xì)胞的死亡〔15〕。表明DAPK對(duì)啟動(dòng)生命體細(xì)胞正常程序性死亡過(guò)程的發(fā)生起著重要作用。多項(xiàng)研究提示〔16〕，DAPK基因不正常表達(dá)主要因其基因上游啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生異常甲基化改變，抑制DAPK的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的過(guò)程，阻礙正常編碼死亡相關(guān)蛋白激酶，使死亡相關(guān)蛋白激酶的表達(dá)比正常水平降低，導(dǎo)致DAPK蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控失去控制，凋亡機(jī)制受到影響，引起細(xì)胞腫瘤化，DAPK對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有著重要聯(lián)系。華海蓉等〔17〕在對(duì)云錫礦工肺癌組織DAPK基因的蛋白表達(dá)及其甲基化異?，F(xiàn)象研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，礦工肺癌組織中缺少或缺乏DAPK基因的表達(dá)，表明DAPK基因異常甲基化改變可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究表明，DAPK在肺癌患者中的痰液及血清中的表達(dá)均有所降低，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究結(jié)果還表明，肺鱗癌患者痰液和血清中DAPK基因啟動(dòng)子甲基化改變較良性肺部疾病患者升高，對(duì)初步區(qū)分腫良惡性有一定的意義。