畢萃萃，劉銀路，楊麗濤，魏芬芬，李勇超，張 波

(北京聯(lián)合大學(xué)，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，是全世界公認(rèn)的嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題［1－2］。糖尿病分為Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes，T1DM)和Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)，T1DM發(fā)病原因主要是由于胰島β細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌不足，常表現(xiàn)為依賴或需要胰島素治療［3］。T2DM是由多因素引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，伴有因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝異常，該病有“三多一少”典型癥狀。其中T2DM的發(fā)病率約為90%。研究表明糖尿病與氧化應(yīng)激關(guān)系密切［4］。Ⅱ型糖尿病患者發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，其常伴隨著腎臟、肝臟、心臟和血管等多個(gè)器官功能的衰竭，長期糖尿病導(dǎo)致微血管血糖升高。糖尿病最主要的并發(fā)癥為糖尿病肝病和糖尿病腎病，主要癥狀為長期的高血糖、高血壓和蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)將惡化為肝硬化和腎衰竭，嚴(yán)重危害人類健康，尚無根治藥物［5－7］。目前市面上調(diào)節(jié)糖尿病代謝的抗氧化劑補(bǔ)充劑有維生素C和維生素E等。劉芬［8］研究了不同抗氧化劑對(duì)2型糖尿病的調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相較于其他抗氧化劑，不同劑量的蝦青素不僅可有效預(yù)防2型糖尿病，更有助于調(diào)節(jié)甘油三酯和體重的下降。故研究蝦青素對(duì)糖尿病肝病和糖尿病腎病的保護(hù)作用有積極意義。

雨生紅球藻為團(tuán)藻目紅球藻科紅球藻屬植物，又名湖生紅球藻或湖生血球藻，廣泛存在于自然界中［9］。雨生紅球藻厚壁孢子經(jīng)高壓均質(zhì)等技術(shù)操作得到雨生紅球藻破壁孢子粉(Sporoderm－broken Spore Powder of Haematococcus pluvialis)，其蝦青素含量極高，是公認(rèn)的天然蝦青素的最好來源［10－12］。蝦青素因其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)活性功能，如抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等，常用于保健食品等領(lǐng)域［13－15］。研究表明，蝦青素是自然界迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的天然抗氧化劑之一，具有清除機(jī)體自由基、增加抗氧化酶活性、減少衰老細(xì)胞堆積和增強(qiáng)細(xì)胞再生能力等重要作用［16－20］。本文主要研究雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的肝腎的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠 (許可證編號(hào):SCXK(京)2012－0001)，體質(zhì)量180±20 g，SPF級(jí)，中國食品藥品檢定研究院;雨生紅球藻破壁孢子粉(蝦青素含量為2%)杭州鑫偉低碳技術(shù)研發(fā)公司提供;鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)美國Sigma公司;鹽酸二甲雙胍 華裕制藥有限公司;0.1 mmol/L檸檬酸緩沖溶液 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;蛋白定量測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;大鼠白介素－1β(IL－1β)酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF－α)酶聯(lián)免疫試劑盒 上海滬尚生物科技有限公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;5804R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;電動(dòng)勻漿器 常州朗越儀器制造有限公司;UV－2450紫外可見分光光度計(jì) 日本津島儀器有限公司;CP324S型電子天平 德國Sartorius公司;ZRXQ003T0型超級(jí)應(yīng)用型純水器 美國Millipore公司;7180型全自動(dòng)生化分析儀 日本日立高新技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng) 現(xiàn)將84只SPF級(jí)SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后分為正常組和造模組。正常組普通飼料飼養(yǎng)，造模組高脂高糖飼料飼養(yǎng)。4周后，造模組70只大鼠腹腔注射一次鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg BW;繼續(xù)飼養(yǎng)4周，測血糖將造模成功大鼠再分為模型組、低劑量組(50 mg/kg BW)、中劑量組(100 mg/kg BW)、高劑量組(200 mg/kg BW)、降糖藥物組(28.5 mg/kg BW)，每組12只大鼠(造模期間有60只大鼠造模成功，為統(tǒng)一每組大鼠均為12只)。試驗(yàn)性大鼠在SPF屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)，溫度控制在(20±2)℃，空氣相對(duì)濕度50%～70%，光照周期為14 h光照(6:00～20:00)/10 h黑暗，自由取食、飲水。

1.2.2 糖尿病模型的建立和雨生紅球藻破壁孢子粉的灌胃 SPF級(jí)SD雄性大鼠飼養(yǎng)4周后，正常組腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸緩沖溶液，造模組腹腔注射一次鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg BW，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，眼眶取血測空腹血糖值，大于11.1 mmol/L則Ⅱ型糖尿病模型成功。正常組大鼠每日給予蒸餾水和普通飼料飼養(yǎng)。低、中、高三個(gè)劑量組分別給予50、100、200 mg/kg BW的雨生紅球藻破壁孢子粉灌胃，降糖藥物組給予28.5 mg/kg BW的鹽酸二甲雙胍灌胃，模型組給予蒸餾水，同時(shí)繼續(xù)高脂高糖飼料飼養(yǎng)4周。

1.2.3 指標(biāo)觀察與測定

1.2.3.1 血清指標(biāo) 測定處死大鼠，取血離心，得到的血清放入－80℃冰箱中用于血糖等指標(biāo)的測定。采用全自動(dòng)分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)活性及白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)含量。

1.2.3.2 肝腎組織抗氧化指標(biāo)測定 處死大鼠后，取肝臟、腎臟放入－80℃冰箱中用于肝腎組織相關(guān)指標(biāo)的測定。將大鼠肝、腎組織從－80℃冰箱中取出，與0.9%生理鹽水按照1∶9的比例混合，制成10%勻漿液，3000 r/min離心10 min取上清，待用。分別取肝腎組織的勻漿液測定SOD、GSH－Px活性和丙二醛MDA含量，測定過程嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒說明書操作。SOD檢測表示每mg蛋白質(zhì)中SOD的活力，單位為U/(mg prot)，GSH－Px的單位為mg GSH/(mg prot)，MDA檢測為每mg蛋白質(zhì)中MDA的含量，單位為mmol/(mg prot)。

1.2.3.3 肝腎組織炎性因子測定 用稀釋好的5%的組織勻漿離心取上清，按照生物素雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定TNF－α和IL－1β含量。

1.2.3.4 肝、腎病理學(xué)觀察 處死大鼠，取肝臟、腎臟于10%中性多聚甲醛固定液中保存待用。取固定液中的肝、腎組織塊，經(jīng)酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片、染色之后，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的形態(tài)變化、炎癥反應(yīng)、纖維化、脂肪空泡等病理改變。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)分析方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響

由表1可知，與正常組相比，模型組大鼠的ALT、AST活性極顯著升高(P＜0.01)，超出正常范圍。ALT和AST是兩個(gè)肝功能的重要指標(biāo)，ALT異常說明有肝變性硬化和肝炎等的可能，AST異常說明有肝細(xì)胞壞死和肝硬化的可能［21－22］，而模型組中兩項(xiàng)指標(biāo)均異常，說明大鼠肝臟功能受損。除低劑量組外，高、中劑量組的雨生紅球藻破壁孢子粉干預(yù)后，ALT、AST活性與模型組比較顯著降低(P＜0.01)，說明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)肝臟有一定的調(diào)節(jié)作用。高劑量組與正常組比較無顯著差異(P＞0.05)，說明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)糖尿病大鼠兩個(gè)肝功能重要指標(biāo)ALT、AST的改善作用明顯。高劑量組與降糖藥物組相比ALT、AST極顯著降低(P＜0.01)，說明高劑量組強(qiáng)于二甲雙胍的作用。

ALP是一種磷酸單酯酶，肝硬化、黃疸者中的ALP過高，重癥慢性腎炎者中的ALP偏低，故作為肝腎疾病的重要指標(biāo)。LDH常見于急性肝細(xì)胞損傷等［23］。模型組大鼠血清ALP、LDH活性極顯著高于正常組大鼠(P＜0.01)，低劑量組中的LDH與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，ALP與模型組有極顯著性差異(P＜0.01)，高、中劑量組雨生紅球藻破壁孢子粉干預(yù)后大鼠血清ALP和LDH活性均極顯著低于模型組(P＜0.01)，且存在雨生紅球藻破壁孢子粉優(yōu)于二甲雙胍(P＜0.05，P＜0.01)的情況。說明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的肝和腎功能或有一定的改善作用。

ALB、GLO通常作為腎臟疾病的指標(biāo)，因?yàn)槟I功能不全易導(dǎo)致白蛋白和球蛋白的流失，形成尿蛋白［24］。模型組大鼠的ALB、GLO極顯著高于正常組大鼠(P＜0.01)，說明模型組大鼠的腎功能可能出現(xiàn)問題。與模型組大鼠比較，低劑量組ALB和GLO均無顯著性差異(P＞0.05)，中劑量組ALB無顯著性差異(P＞0.05)，GLO有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組雨生紅球藻破壁孢子粉干預(yù)后ALB、GLO含量顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。說明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)ALB和GLO含量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而改善腎功能。

2.2 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝腎抗氧化指標(biāo)的影響

SOD、GSH－Px和MDA為常見的抗氧化檢測指標(biāo)。SOD和GSH－Px可有效清除體內(nèi)自由基，有效防止脂質(zhì)過氧化，MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，有一定毒性，會(huì)引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子的交聯(lián)聚合，從一定程度上反映了糖尿病的機(jī)理［25］。由表2可知，與正常組相比，模型組大鼠肝腎組織MDA含量極顯著升高(P＜0.01)，SOD和GSH－Px活性極顯著降低(P＜0.01)，說明模型組大鼠肝腎有一定程度的損傷。與模型組相比，雨生紅球藻破壁孢子粉干預(yù)后，各組MDA含量顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)，SOD活性極顯著升高(P＜0.01)。高劑量組的GSH－Px活性極顯著升高(P＜0.01)，中劑量組肝臟的GSH－Px活性極顯著升高(P＜0.01)，腎臟中的GSH－Px活性與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，低劑量組與模型組無顯著性差異(P＞0.05)。雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)體內(nèi)氧化反應(yīng)有一定緩解作用。且高劑量的雨生紅球藻破壁孢子粉效果極顯著優(yōu)于二甲雙胍(P＜0.01)。

表1 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響(n=12)Table 1 Influences of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis to indicators related to serum of diabetes model rats(n=12)

表2 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟和腎臟SOD，GSH－Px，and MDA的影響(n=12)Table 2 Influences of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on SOD，GSH－Px，and MDA of liver and kidney of diabetes model rats(n=12)

表3 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝腎組織TNF－α、IL－1β含量的影響(n=12)Table 3 Effect of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on IL－1β，TNF－αof liver and kidney in diabetic rats(n=12)

2.3 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝腎組織TNF－α、IL－1β含量的影響

IL－1β和TNF－α為常見的細(xì)胞炎性因子，白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化、增殖與分化中起重要作用，也是重要的炎癥因子［26］。由表3可知，與正常組相比，模型組大鼠肝腎組織的IL－1β和TNF－α含量極顯著升高(P＜0.01)，與模型組大鼠相比，雨生紅球藻破壁孢子粉低劑量組IL－1β和TNF－α含量無顯著性差異(P＞0.05)，中劑量組肝臟的IL－1β含量有顯著性差異(P＜0.05)，TNF－α含量無顯著性差異(P＞0.05)，腎臟的IL－1β和TNF－α含量極顯著降低(P＜0.01)，高劑量組IL－1β和TNF－α含量均極顯著降低(P＜0.01)，且高劑量的雨生紅球藻破壁孢子粉效果優(yōu)于二甲雙胍。炎性因子含量越多說明體內(nèi)的炎癥反應(yīng)情況越嚴(yán)重，而肝腎中的炎癥反應(yīng)在一定程度上體現(xiàn)了其肝腎功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)大鼠肝腎有一定的改善作用。

2.4 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝腎組織病理切片的影響

由圖1可知，正常組可見清晰中央靜脈，肝竇和細(xì)胞索排列正常，且肝小葉分界清晰可見，肝細(xì)胞胞質(zhì)均勻且無顆粒和脂肪變性，無纖維化(圖1a);模型組大鼠肝組織中央靜脈結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞索和肝竇排列無規(guī)律不規(guī)則，部分肝細(xì)胞腫脹且有輕度變形，細(xì)胞核濃縮，胞質(zhì)顆粒變性，肝中央靜脈有淤血現(xiàn)象(圖1b)。雨生紅球藻破壁孢子粉高劑量組肝組織中央靜脈清晰，肝細(xì)胞索排列較正常(圖1c)。由圖1可以看出，隨著雨生紅球藻破壁孢子粉劑量增大，糖尿病引起的肝臟損傷的改善作用也越來越顯著。

由圖1可知，正常組腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則，腎小球基底膜未見異常，腎小管結(jié)構(gòu)無明顯纖維化，腎小囊體積、囊腔腔隙正常，近曲小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1g)。模型組腎小囊囊腔變小，系膜內(nèi)漿液浸潤，腎小球體積變大且系膜增厚，系膜細(xì)胞增生嚴(yán)重，局部出現(xiàn)腎小球硬化;腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)擴(kuò)張，萎縮(圖1h)。雨生紅球藻破壁孢子粉高劑量組腎臟組織結(jié)構(gòu)較明顯，囊腔腔隙較正常，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)較正常(圖1i)。由圖1可以看出，隨著雨生紅球藻破壁孢子粉劑量的增大，糖尿病引起的腎臟損傷的改善作用也越來越顯著。

3 討論與結(jié)論

圖1 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)大鼠肝腎組織病理切片的影響(HE，400×)Fig.1 Effects of sporoderm－broken spore powder of Haematoccus pluvialis on pathological injury of liver and kidney in diabetic rats(HE，400×)

糖尿病肝病和糖尿病腎病是糖尿病引起的重要器官損傷［27－31］。糖尿病肝病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為肝糖原沉積、肝內(nèi)脂肪滴增多且出現(xiàn)脂肪變性、非特異性細(xì)胞變性如肝細(xì)胞水腫以及肝硬化等。糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭，引起死亡的主要原因之一。其主要的特征是蛋白尿、腎小球肥大、腎小管濾過率低和腎臟纖維化等腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)和功能改變［32－33］。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高血糖是糖尿病腎病中代謝和血管異常的主要原因，持續(xù)的高血糖引起的機(jī)體大量活性氧自由基產(chǎn)生，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，給予抗氧化劑治療可顯著抑制糖尿病腎病的腎臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯著減輕糖尿病腎病腎臟組織的纖維化程度［34－35］。前期研究了雨生紅球藻源蝦青素對(duì)糖尿病小鼠的降糖作用以及雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)小鼠酒精性肝腎損傷的保護(hù)作用，結(jié)果均顯示良好，且糖尿病會(huì)引發(fā)肝腎損傷，故在糖尿病的基礎(chǔ)上研究雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)肝腎損傷的保護(hù)作用有重要的研究意義［36－38］。本研究中，通過高脂高糖飲食并注射STZ后血糖值大于11.1 mmol/L，制造Ⅱ型糖尿病模型［39］。模型組大鼠血清中與肝臟功能密切相關(guān)的酶如ALT、AST、LDH、ALP活性均極顯著升高(P＜0.01)，肝腎組織的SOD、GSH－Px的酶活性極顯著降低(P＜0.01)，MDA含量極顯著升高(P＜0.01)，提示肝腎功能可能受到損害。經(jīng)口給予高劑量雨生紅球藻破壁孢子粉后，Ⅱ型糖尿病大鼠肝腎臟組織ALT、AST、ALP、LDH、ALB、GLO均顯著降低(P＜0.05)，同時(shí)，肝腎組織的SOD、GSH－Px酶活性極顯著升高、MDA含量極顯著降低(P＜0.01)，說明雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)高脂高糖飲食并注射STZ的Ⅱ型糖尿病大鼠的肝腎損害有一定的緩解作用。肝腎組織病理切片也表明，經(jīng)口給予雨生紅球藻破壁孢子粉可顯著改善肝組織形態(tài)、肝細(xì)胞索和肝竇排列，顯著改善腎小球、腎小管組織狀態(tài)，囊腔腔隙結(jié)構(gòu)等。綜上所述，經(jīng)口給予雨生紅球藻破壁孢子粉，可顯著改善高糖高脂Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟和腎臟的結(jié)構(gòu)和功能。雨生紅球藻可輔助治療高脂高糖引起的Ⅱ型糖尿病。但目前機(jī)理尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。