劉文穎，張銘晧，高麗輝，馮曉文，李國明，谷瑞增

(1.浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江寧波315832;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015;3.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京100083;4.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京102206)

三文魚皮是水產(chǎn)加工的副產(chǎn)物，除少數(shù)用于生產(chǎn)魚粉、作為飼料和肥料外，大多數(shù)被丟棄，造成很大的資源浪費［1］。三文魚皮中蛋白含量很高，其中膠原蛋白含量最高可超過其蛋白質(zhì)總量的80%［2］，較魚體其它部位的膠原蛋白要高許多，并且具有安全性高，無瘋牛病及口蹄疫隱患等優(yōu)點［3］。三文魚皮膠原低聚肽是以三文魚皮為主要原料，經(jīng)過酶解、分離純化等生產(chǎn)的分子量在1000 u以下的小肽混合物。本中心前期研究表明，三文魚皮膠原低聚肽中蛋白質(zhì)含量很高(92.2%)，必需氨基酸含量豐富(33.7%)，主要為二肽、三肽(69.3%)，具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、血管舒張等作用［1，3－4］。

人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會引起體內(nèi)脂類氧化、腦部損傷，產(chǎn)生黃褐斑，增加阿爾茨海默癥發(fā)病率，誘發(fā)癌癥等［5－7］。目前常用的抗氧化劑大多屬于人工合成物，雖然有較強的抗氧化能力，但其潛在的危害使人們越來越關注安全、無毒的新型天然抗氧化劑［8］。許多研究證實，肽類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，但其經(jīng)口服進入人體后，受胃腸道中各種消化酶的作用，可能會造成生物活性的降低［9－10］。目前，關于三文魚皮膠原低聚肽消化前后抗氧化活性的研究鮮見報道。

本研究采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對三文魚皮膠原低聚肽進行體外模擬消化，探討消化前后三文魚皮膠原低聚肽分子量的變化;通過DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、總抗氧化能力(ABTS法)以及人肝星狀細胞(HSC)活性氧ROS實驗，考察三文魚皮膠原低聚肽消化前后抗氧化能力的變化，為其在抗氧化功能性食品的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三文魚皮 北京中食海氏生物技術有限公司;胃蛋白酶(≥250 U/mg)、2＇，7＇－二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH－DA)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、分子量標準品 美國Sigma公司;胰蛋白酶(≥250 NFU/mg) 美國Solarbio公司;乙腈(色譜純) 美國Fisher公司產(chǎn)品;總抗氧化能力檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所;人肝星狀細胞(HSC)上海冠導生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基 Hyclon公司;胎牛血清 杭州四季青公司;其他試劑 分析純，北京化工廠。

HF90 CO2培養(yǎng)箱 上海力申科學儀器有限公司;Spectra MR多功能酶標儀 美國Dynex;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司;LC－20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三文魚皮膠原低聚肽的制備 將三文魚皮用蒸餾水洗凈，稱取600 g絞碎，加入蒸餾水進行勻漿。90℃加熱15 min后，降溫至50℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，以每克原料2500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h后，再以每克原料3000單位的酶量加入木瓜蛋白酶，繼續(xù)酶解2 h。其間用0.1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)水解液，保持pH不變。酶解結(jié)束后在100℃沸水浴條件下滅酶，10000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)超濾和離子交換樹脂分級分離，然后進行噴霧干燥，得到三文魚皮膠原低聚肽干粉［11］。

1.2.2 體外模擬消化實驗

1.2.2.1 體外模擬胃液消化實驗 將5.0 g三文魚皮膠原低聚肽和0.2 g NaCl溶解于去離子水中，用1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，37℃水浴，加入0.05 g胃蛋白酶恒溫消化2 h，100℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)p H至7.5，定容至100 mL?？瞻讓φ詹捎孟嗤幚矸椒?，不加胃蛋白酶［12－13］。

1.2.2.2 體外模擬腸液消化實驗 將5.0 g三文魚皮膠原低聚肽和0.68 g KH2PO4溶解于去離子水中，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，37℃水浴，加入0.05 g胰蛋白酶恒溫消化4 h，100℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫，定容至100 mL?？瞻讓φ詹捎孟嗤幚矸椒ǎ患右鹊鞍酌福?2－13］。

1.2.3 分子量分布測定 采用高效液相凝膠色譜法進行分子量分布分析。色譜柱:TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸，45∶55∶0.1(體積比);流速:0.5 mL/min;進樣體積:10μL;檢測波長:220 nm;柱溫:30℃。用流動相將樣品濃度配制為1.0 mg/mL，經(jīng)孔徑0.2μm聚四氟乙烯濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進行凝膠過濾，紫外檢測器進行檢測，最后通過GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時以乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(分子量189 u)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(分子量451 u)、桿菌酶(分子量1450 u)和細胞色素C(分子量12500 u)為標準品溶液，配制成0.1%(M/V)的濃度，制作分子量標準曲線［11］，方程為:lgMW=6.880023－0.2122526t，R2=0.996。

1.2.4 DPPH自由基清除率測定 將不同濃度的樣品溶液分別與0.1 mmol/L DPPH－無水乙醇溶液等體積比混合均勻，室溫避光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光值AX;以不同濃度的樣品溶液與無水乙醇等體積混合，測得吸光值A0;以蒸餾水代替樣品作為空白對照，與同體積0.1 mmol/L DPPH－無水乙醇溶液混合，測得吸光值A1［14］。

1.2.5 羥基自由基清除率測定 將不同濃度的樣品溶液與5.0 mmol/L FeSO4溶液、5.0 mmol/L水楊酸－無水乙醇溶液以1∶2∶2的體積均勻混合。實驗組以1體積5.0 mmol/L H2O2溶液開啟反應;對照組以1體積蒸餾水開啟反應;空白對照組以蒸餾水代替樣品。37℃恒溫孵育1 h后于510 nm處測量吸光值，實驗組、對照組和空白對照組的吸光值分別記為AX、A0、A1［15］。

表1 不同處理的三文魚皮膠原低聚肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of SSCPwith different treatments

1.2.6 總抗氧化能力測定 將ABTS溶液與過硫酸鉀發(fā)生反應生成墨綠色ABTS+工作液，靜置12 h后備用。每個孔中加入200μL稀釋35倍的工作液。向標準曲線檢測孔中加入10μL 0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的Trolox(水溶性維生素E)標準溶液，向樣品檢測孔加入樣品10μL，輕輕混勻后室溫孵育6 min，于734 nm處測定吸光值。最終樣品的抗氧化能力以mmol/L Trolox表示［16］。

1.2.7 細胞活性氧ROS測定 將HSC細胞接入6孔板，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將細胞隨機分為空白組對照組、模型對照組、胃(胰)蛋白酶消化組、胃(胰)蛋白酶對照組，用DMEM培養(yǎng)基稀釋樣品至400μg/mL，將1.0 mL樣品加入細胞中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，向6孔板中加入1.0 mL DCFH－DA，37℃處理30 min，再加入1.0 mL AAPH，建立ROS誘導的HSC細胞氧化應激模型，空白對照則不加，反應20 min，用流式細胞儀測定細胞熒光值的變化［17］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3次，使用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化前后三文魚皮膠原低聚肽相對分子質(zhì)量分布

分子量分布分析結(jié)果表明，三文魚皮膠原低聚肽的相對分子量主要在1000 u以下，占總比例的87%以上，大多由小于八個氨基酸的短肽組成，具有良好的水溶性、消化吸收性。三文魚皮膠原低聚肽經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，部分肽段會生成小肽和氨基酸，使得分子量變小，但從表1可知，三文魚皮膠原低聚肽的重均分子量僅輕微減少，變化不超過4%，這表明三文魚皮膠原低聚肽有較強的抗消化能力，小肽尤其是抗氧化性短肽基本不受蛋白酶作用的影響。

2.2 消化前后三文魚皮膠原低聚肽的DPPH自由基清除能力

胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后，三文魚皮膠原低聚肽對DPPH自由基清除能力的變化見圖1。由圖1可知，三文魚皮膠原低聚肽的DPPH自由基清除能力呈量效關系，隨著濃度的提高，DPPH自由基清除能力增強。未經(jīng)處理的低聚肽抗氧化能力稍強于消化后的肽，胃蛋白酶消化前后，IC50值分別為11.1、12.3 mg/mL，胰蛋白酶消化前后，IC50值分別為12.5、14.6 mg/mL。因此，經(jīng)模擬消化后，三文魚皮膠原低聚肽的抗氧化性略有下降，但仍可保持較高的水平。鄭婷婷等［18］通過模擬胃腸道消化對魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力進行了考察，發(fā)現(xiàn)魚鰾膠原肽的抗氧化活性保持率無明顯變化，具有較好的消化穩(wěn)定性，與本研究結(jié)果相符。

圖1 不同處理的三文魚皮膠原低聚肽對DPPH自由基清除作用Fig.1 DPPH free radical scavenging effect of SSCPwith different treatments

2.3 消化前后三文魚皮膠原低聚肽的羥自由基清除能力

圖2 顯示了胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后三文魚皮膠原低聚肽對羥自由基清除能力的變化。三文魚皮膠原低聚肽的羥自由基清除能力隨濃度的升高而加強。經(jīng)蛋白酶消化后，低聚肽的羥自由基清除能力與未處理的基本相同，僅有輕微下降。胃蛋白酶消化前后，IC50值分別為12.2、13.2 mg/mL，胰蛋白酶消化前后，IC50值分別為10.7、11.5 mg/mL，說明三文魚皮膠原低聚肽對羥自由基清除能力具有較好的消化穩(wěn)定性。有研究考察了體外模擬消化對魚鰾膠原肽羥自由基清除能力變化的影響，結(jié)果與本研究一致，消化酶對其羥自由基清除能力無顯著性影響［19］。

圖2 不同處理的三文魚皮膠原低聚肽對·OH清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging effect of SSCPwith different treatments

2.4 消化前后三文魚皮膠原低聚肽的總抗氧化能力

以Trolox標準品繪制的ABTS標準曲線由圖3所示，消化酶處理前后三文魚皮膠原低聚肽的ABTS自由基抑制能力由圖4所示。胃蛋白酶消化后，三文魚皮膠原低聚肽對ABTS自由基的抑制能力下降不超過13%;胰蛋白酶消化后，對ABTS自由基的抑制能力下降不超過19%。這是由于胃、胰蛋白酶會使一些具有抗氧化活性的肽段結(jié)構(gòu)被降解，導致消化產(chǎn)物的抗氧化活性有所降低，但是本研究中三文魚皮膠原低聚肽仍然保留了較多的ABTS自由基抑制能力，這表明其在ABTS自由基抑制活性方面具有一定的消化穩(wěn)定性。劉珊珊等［19］利用胃蛋白酶消化酪蛋白抗氧化肽，結(jié)果表明消化后對其ABTS自由基抑制能力無顯著性影響，與本文結(jié)果一致。

圖3 ABTS標準曲線Fig.3 ABTSstandard curve

2.5 消化前后三文魚皮膠原低聚肽對HSC中ROS清除能力

圖4 不同處理的三文魚皮膠原低聚肽的總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of SSCPwith different treatments

細胞熒光值越低，表明ROS清除能力越強。由圖5可知，與模型對照相比，消化前后三文魚皮膠原低聚肽均能顯著地清除HSC中ROS(P＜0.05)。消化前后對細胞內(nèi)ROS的清除能力基本持平，胃、胰蛋白酶消化后ROS清除能力略有提高，但胃蛋白酶消化后提高不超過3%，胰蛋白酶消化后提高不超過5%，消化前后對比沒有顯著性差異(P＞0.05)。低聚肽在消化階段可能暴露出較多的活性基團，與活性氧發(fā)生反應的機會增加，從而增強其抗氧化能力［19－20］。由此可知，在體外模擬消化條件下，蛋白酶對三文魚皮膠原低聚肽的ROS清除率影響并不大，消化后可較好地保持生物活性，這為該類肽作為保健食品主要功能成分的應用奠定了一定基礎。

圖5 不同處理的三文魚皮膠原低聚肽對HSC中ROS清除能力的影響Fig.5 Effect of SSCPwith different treatments on ROSscavenging activity in HSC

3 結(jié)論

以三文魚皮為原料通過兩步酶解法制備三文魚皮膠原低聚肽，通過分子量分布分析、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、總抗氧化能力以及HSC細胞ROS實驗，研究了體外模擬消化對三文魚皮膠原低聚肽抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)模擬消化實驗后，三文魚皮膠原低聚肽的重均分子量變化很小，不超過4%;胃蛋白酶消化前后，DPPH自由基清除能力IC50值分別為11.1、12.3 mg/mL，胰蛋白酶消化前后，IC50值分別為12.5、14.6 mg/mL;胃蛋白酶消化前后，羥自由基清除能力IC50值分別為12.2、13.2 mg/mL，胰蛋白酶消化前后，IC50值分別為10.7、11.5 mg/mL;胃蛋白酶消化前后，總抗氧化能力下降不超過13%，胰蛋白酶消化前后，總抗氧化能力下降不超過19%;胃蛋白酶消化前后，ROS清除能力提高不超過3%，胰蛋白酶消化前后，ROS清除能力提高不超過5%。本研究證實了三文魚皮膠原低聚肽具有較強的消化穩(wěn)定性和抗氧化活性，為其在天然功能性保健食品中的應用提供了思路和理論支持。