向凡舒，朱媛媛，鄧 風，鐘小丹，張振東，郭 壯，*

(1.湖北文理學院食品科學技術學院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053;2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北孝感432003)

米酒作為我國獨具特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因其口感溫潤、酒香柔和而深受消費者的青睞，我國湖北、四川和廣西等地區(qū)的居民均具有食用米酒的習俗［1］。米酒品質(zhì)的好壞與所用米酒曲中微生物的構成息息相關，因而自古就有“曲，酒之骨”的說法［2］。近年來，我國學者對米酒曲微生物群系開展了系列研究工作。郝瑩［3］和蔡海鶯等［4］采用純培養(yǎng)技術，發(fā)現(xiàn)霉菌和酵母菌為陜北和蘇州等地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢真菌;本研究團隊采用變性凝膠梯度電泳和純培養(yǎng)技術對中國地理標識產(chǎn)品——孝感鳳窩酒曲微生物多樣性進行了解析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和魏斯氏菌屬為其優(yōu)勢細菌屬［5－6］。

以MiSeq為代表的第二代高通量測序技術，具有檢測數(shù)據(jù)量大和準確快速的特點［7］，在環(huán)境生物學［8］、食品微生物學［9］和臨床分子學［10］等領域均有廣泛的應用。寧亞麗采用該技術對朝鮮族傳統(tǒng)米酒曲中微生物多樣性進行了解析［11］，結果發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和伯頓絲孢畢赤酵母為其優(yōu)勢真菌屬，而乳桿菌屬和腸桿菌屬為其優(yōu)勢細菌屬;楊春敏對海南山蘭米酒曲微生物多樣性進行了解析［12］，結果表明根霉屬是酒曲中優(yōu)勢真菌屬，而片球菌為優(yōu)勢細菌屬;本研究團隊對孝感鳳窩酒曲研究發(fā)現(xiàn)淀粉霉屬和復膜孢酵母屬為其優(yōu)勢真菌屬［13］，而芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬為其優(yōu)勢細菌屬［14］。由此可見，因制作原料、工藝和地域環(huán)境等因素的影響，不同地區(qū)制作的米酒曲其蘊含的微生物類群也各不相同。位于鄂西地區(qū)的恩施土家族苗族自治州建始縣屬濕潤型山地氣候，境內(nèi)富含硒等元素，當?shù)鼐用褚嘤凶灾泼拙魄l(fā)酵米酒的習俗，獨特的生態(tài)環(huán)境可能賦予了米酒曲特有的微生物類群，然而目前關于建始縣乃至整個鄂西地區(qū)米酒曲微生物多樣性研究的報道尚少。

本研究以建始地區(qū)米酒曲為研究對象，在采用第二代MiSeq高通量測序技術對其細菌和真菌多樣性進行解析的基礎上，進一步探討了各微生物類群間的相關性，同時采用純培養(yǎng)技術對其蘊含的乳酸菌和酵母菌菌株分離鑒定，以期為后續(xù)米酒食用品質(zhì)的提升提供一定的理論參考，同時為具有優(yōu)良發(fā)酵特性米酒生產(chǎn)用菌株的篩選提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒曲 采自湖北省恩施土家族苗族自治州建始縣(E109°32＇～110°12＇，N30°32＇～30°54＇);MRS、PDA培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司;Axygen清潔試劑盒 康寧生命科學吳江有限公司;QIAGEN DNeasymericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司;5×TransStartTM FastPfu Buffer、dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司;引物對338F/806R、27F/1495R、M13F(－47)/M13R(－48)、SSU0817F/SSU1196R、NS1/NL4 天一輝遠(武漢)生物科技有限公司;Escherichia coli top10 湖北文理學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自制。

ND－2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;DG250型厭氧工作站 英國Don Whitley公司;PTC－100型PCR儀 美國ABI公司;Fluor Chem FC3型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國Protein Simple公司;ECLIPSE CI生物顯微鏡 日本Nikon公司;Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米酒曲樣品的采集 于2018年12月下旬從湖北省建始縣隴里集鎮(zhèn)菜市場采集到4份米酒曲樣品，編號為JS1、JS2、JS3和JS4，所有酒曲均在建始縣當?shù)刂谱鞑N售。

1.2.2 米酒曲微生物基因組DNA提取、PCR擴增和高通量測序 基因組DNA提取:將米酒曲樣品用滅菌后的研缽磨成粉末狀，每份樣品各取2 g，按照DNA基因組提取試劑盒使用說明提取樣品總DNA。

PCR擴增:將成對的核苷酸標簽(barcode)加入引物對338F/806R中用以區(qū)分和歸并每個樣品的序列，參照文獻［15］中的方法對細菌16S rRNA V3－V4區(qū)PCR進行擴增，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測;參照王玉榮的方法對真菌18SrRNA V4－V5區(qū)PCR進行擴增［16］，并使用1.5%的瓊脂糖凝膠對其進行電泳檢測。

高通量測序:將檢測合格的擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。

1.2.3 高通量測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控及生物信息學分析 參照文獻［15］中的方法對下機序列進行拼接和質(zhì)控，使用QIIME(v1.70)平臺對質(zhì)控后的有效序列進行微生物多樣性評價。經(jīng)97%相似性序列劃分后構建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units，OTU)，從每個OTU中選擇1條代表性序列與Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫進行同源性比對并標注其分類學地位。

1.2.4 米酒曲中乳酸菌和酵母菌的分離鑒定 乳酸菌的分離與鑒定:采用倍比稀釋涂布平板法，將米酒曲粉末稀釋至10－3～10－5梯度，各吸取100μL稀釋液涂布于含1.0%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，挑取含有透明圈的單菌落劃線3次以達到純化目的，同時對其進行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色，將純化的過氧化氫酶實驗為陰性，且革蘭氏染色為陽性的菌株使用30%的甘油保藏至－80℃。參照尚雪嬌等［17］的方法進行疑似乳酸菌菌株DNA提取、PCR擴增、連接轉(zhuǎn)化和測序，將測序返回的菌株序列在美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)進行比對。

酵母菌的分離與鑒定:倍比稀釋方法與乳酸菌相同，選擇PDA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～5 d后，挑取單菌落進行純化，將純化后的疑似酵母菌菌株使用30%的甘油保藏至－80℃。參照王玉榮等［16］的方法對疑似酵母菌菌株進行后續(xù)鑒定測序，菌株序列同源性比對方法同乳酸菌。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用R軟件(v3.6.2)將測序得到的數(shù)據(jù)進行作圖分析，利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時采用SAS 9.0軟件計算米酒曲中細菌屬與真菌屬間的相關性系數(shù)及顯著值。

圖1 基于門(A)和屬(B)水平相對含量＞1.0%細菌的構成Fig.1 The diversity of bacteria with relative abundance more than 1.0%at phylum(A)and genus levers(B)

2 結果與分析

2.1 基于高通量測序技術建始米酒曲中細菌多樣性分析

通過MiSeq高通量測序技術，4個米酒曲樣品共產(chǎn)生155213條16SrDNA序列，平均每個樣品38803條，其中JS1、JS2、JS3和JS4的序列數(shù)分別為40509條、51134條、29956條和33614條;經(jīng)OTU劃分后產(chǎn)生4125個OTU，其中JS1、JS2、JS3和JS4的OTU數(shù)分別為1389、1478、1387和753，平均每個樣品含有個1252個OTU。從每個OTU中挑選1個代表性序列進行比對，進而解析細菌多樣性，基于門和屬水平相對含量＞1.0%細菌的構成如圖1所示。

由圖1(A)可知，米酒曲中有2個平均相對含量＞1.0%的細菌門，分別是Proteobacteria(變形菌門，59.64%)和Firmicutes(厚 壁 菌 門，34.98%)，其 中Proteobacteria在樣品JS2、JS3和JS4中相對含量最高，分別為84.03%、74.88%和75.54%，而Firmicutes在樣品JS1中含量最高，為86.17%。由圖1(B)可知，米酒曲中平均相對含量＞1.0%的細菌屬共有8個，其中隸屬于Proteobacteria的有Pseudomonas(假單 胞 菌 屬，40.10%)、Enterobacter(腸 桿 菌 屬，3.50%)、Pantoea(泛菌屬，2.86%)和Klebsiella(克雷伯菌屬，2.29%);隸屬于Firmicutes的有Pediococcus(片 球 菌 屬，14.41%)、Weissella(魏 斯 氏 菌 屬，9.62%)、Bacillus(芽孢桿菌屬，5.44%)和Lactococcus(乳球菌屬，2.18%)。作為食品工業(yè)中最常使用的菌株，乳酸菌具有提升產(chǎn)品品質(zhì)和賦予產(chǎn)品特殊功效的作用［18］，本研究中隸屬于乳酸菌的Pediococcus、Weissella和Lactococcus等3個屬的累計相對含量達到26.21%，由此可見，建始地區(qū)米酒曲中蘊含了豐富的乳酸菌菌種資源，本研究團隊前期對孝感鳳窩酒曲的研究亦發(fā)現(xiàn)了同樣的結論［14］，因而后續(xù)研究中積極開展米酒曲源乳酸菌菌株的收集保藏工作具有積極的意義。值得一提的是，Pseudomonas在所有米酒曲中均存在且相對含量最高，有報道指出隸屬于該屬的某些種具有一定的條件致病性，例如，P.aeruginosa(綠膿桿菌)可導致甲溝炎的發(fā)生［19］。雖然Enterobacter、Pantoea和Klebsiella在米酒曲中的相對含量遠低于Pseudomonas，但亦有報道指出E.aerogenes(產(chǎn)氣腸桿菌)［20］、P.agglomerans(成團泛菌)［21］和K.pneumoniae(肺炎克雷伯菌)［22］對抗生素均具有一定的抗性并可導致炎癥的發(fā)生。米酒曲中條件致病菌相對較多的原因可能與其制作環(huán)境相對開放有關，因而后續(xù)著力改善生產(chǎn)環(huán)境進而提升產(chǎn)品的食用安全品質(zhì)是極為必要的。

本研究進一步在OTU水平上對米酒曲的細菌多樣性進行了解析，共發(fā)現(xiàn)4118個OTU，且76個為核心OTU在所有樣品中均存在，其中平均相對含量大于1.0%的核心OTU如圖2所示。

圖2 相對含量大于1.0%核心細菌類群Fig.2 The core bacterial groups with relative abundance more than 1.0%

由圖2可知，共有10個平均相對含量＞1.0%的核心OTU，其中各有5個隸屬于Pseudomonas、1個隸屬于Klebsiella，累計相對含量分別達到38.79%和2.24%;各有2個隸屬于Weissella、1個隸屬于Pediococcus，累計相對含量分別達到7.89%和7.24%;亦有1個隸屬于Bacillus，平均相對含量為5.22%。值得一提的是，10個OTU的累計含量高達61.38%，因而建始地區(qū)米酒曲中共有大量的細菌核心菌群。

2.2 基于高通量測序技術建始米酒曲中真菌多樣性分析

除細菌外，米酒曲中部分真菌具有較高的乙醇耐受性［23］和產(chǎn)香特性［24］，對后續(xù)米酒品質(zhì)的形成具有決定性的作用，例如從米酒曲中分離出的M.indicus(印度毛霉)能使米酒主體香氣中的異戊醇、乙酸苯乙酯和棕櫚酸乙酯等含量顯著提高［24］，因而本研究進一步對米酒曲中真菌多樣性進行了解析。MiSeq測序結果顯示4個米酒曲樣品共產(chǎn)生了142018條18S rDNA序列，平均每個樣品35504條，其中JS1、JS2、JS3和JS4的序列數(shù)分別為35201條、35320條、38870條和32627條;經(jīng)97%相似度劃分后產(chǎn)生4125個OTU，其中JS1、JS2、JS3和JS4的OTU數(shù)分別為282、361、371和221，平均每個樣品含有個309個OTU。經(jīng)序列比對后，基于門和屬水平相對含量＞1.0%的真菌構成如圖3所示。

圖3 基于門(A)和屬(B)水平相對含量＞1.0%真菌的構成Fig.3 The diversity of fungus with relative abundance more than 1.0%at phylum(A)and genus levers(B)

由圖3(A)可知，米酒曲中Mucoromycotina(毛霉亞門)和Ascomycota(子囊菌門)2個真菌門平均相對含量大于＞1.0%，分別為59.64%和34.98%。從圖3(B)可知，平均相對含量＞1.0%的真菌屬共有3個，其中隸屬于Mucoromycotina的為Amylomyces(淀粉霉屬)和Saccharomycopsis(復膜孢酵母屬)，隸屬于Ascomycota的為Wickerhamomyces(威克漢姆酵母屬)，平均相對含量為49.97%、39.47%和3.95%。

四個米酒曲樣品共劃分了1083個OTU，其中包含18個核心OTU，平均相對含量＞1.0%的核心OTU僅有4個，如圖4所示。

圖4 相對含量大于1.0%核心真菌類群Fig.4 The core fungal groups with relative abundance more than 1.0%

由 圖4可 知，OTU995、OTU334、OTU1037和OTU229，分別隸屬于Mucor(毛霉屬)、Saccharomycopsis、Amylomyces和Wickerhamomyces，平均相對含量分別為1.60%、39.39%、48.82%和3.95%。雖然僅有4個平均相對含量＞1.0%的核心OTU存在所有樣品中，但其累計含量高達93.76%，因而建始地區(qū)米酒曲中亦共有大量的真菌核心菌群。

2.3 建始米酒曲中乳酸菌的分離鑒定

高通量測序結果表明，建始地區(qū)米酒曲中蘊含了豐富的乳酸菌菌種資源，本研究進一步對乳酸菌菌株進行了分離、純化和鑒定，從4個米酒曲中共分離出10株乳酸菌，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

由圖5可知，在10株乳酸菌中4株被鑒定為P.pentosaceus(戊糖片球菌)，1株被鑒定為P.acidilactici(乳酸片球菌)，2株被鑒定為L.brevis(短乳桿菌)，3株被鑒定為E.faecium(屎腸球菌)。由此可見，P.pentosaceus占分離株的40%，為建始地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢乳酸菌。然而張振東等［5］卻從采集自孝感、隨州、玉林和蘇州等地區(qū)的米酒曲中分離出了較多的E.faecium分離株，可見地域差異使得米酒曲中蘊含的細菌類群也存在著較大的不同。

圖5 乳酸菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree oflactic acid bacteria isolates

2.4 建始米酒曲中酵母菌的分離鑒定

本研究亦采用傳統(tǒng)微生物學的方法對米酒曲中酵母菌進行了分離，并對分離株18S rDNA序列進行擴增和鑒定，其結果如圖6所示。

圖6 酵母菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of yeast isolates

由圖6可知，從4個建始米酒曲中共分離出10株酵母菌，其中菌株YJS4－1和YJS4－4被鑒定為S.cerevisiae(釀酒酵母)，菌株YJS1－1被鑒定為Wanomalus(海洋嗜殺酵母)，而其余7株酵母菌都被鑒定為S.fibuligera(扣囊復膜酵母)。由此可見，S.fibuligera占分離株的70%，為建始地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢酵母。近年來，越來越多的研究表明S.fibuligera存在于各種酒曲中，具有產(chǎn)β－葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶的特性［25］，此外亦具有產(chǎn)香產(chǎn)酯的功效［26］，因而在后續(xù)研究中進行具有高產(chǎn)酶活性和優(yōu)良發(fā)酵特性S.fibuligera菌株的篩選，對米酒產(chǎn)品品質(zhì)的提升具有積極的意義。

圖7 相對含量大于1.0%細菌(A)、真菌(B)及細菌和真菌(C)相關系數(shù)的熱圖Fig.7 The heatmap of correlation coefficient among bacteria(A)，fungus(B)and between bacteria and fungus(C)

2.5 細菌和真菌相對含量＞1.0%菌屬相關性分析

在對米酒曲細菌和真菌多樣性進行解析的基礎上，本研究對其相對含量＞1.0%的菌屬相關性進行了分析，結果如圖7所示。

由圖7(A)可知，Lactococcus和Pediococcus呈現(xiàn)極顯著正相關(R=0.999，P＜0.001);Klebsiella與Enterobacter和Pantoea均呈現(xiàn)極顯著正相關(P＜0.001)，相關系數(shù)均為1.0;Enterobacter與Pantoea亦呈現(xiàn)極顯著正相關(P＜0.001)，相關系數(shù)亦為1.0。由此可見，米酒曲中隸屬于乳酸菌的菌屬之間可能呈現(xiàn)一定的共生關系，而這種現(xiàn)象在Klebsiella、Pantoea和Enterobacter等條件致病菌之間亦可能存在。由圖7(B)可知，Saccharomycopsis和Amylomyces呈現(xiàn)顯著負相關(R=－0.976，P=0.023)，而由圖7(C)可知細菌和真菌之間無顯著相關性(P＞0.05)。

3 結論

本研究以建始地區(qū)米酒曲為研究對象，采用MiSeq高通量測序技術對其微生物多樣性進行了解析，結果發(fā)現(xiàn)隸屬于Proteobacteria的Pseudomonas、Enterobacter、Pantoea和Klebsiella及隸屬于Firmicutes的Pediococcus、Weissella、Bacillus和Lactococcus為其主要細菌類群，隸屬于Mucoromycotina的Amylomyces和 Saccharomycopsis及隸屬于 Ascomycota的Wickerhamomyces為主要真菌類群。通過純培養(yǎng)技術進一步發(fā)現(xiàn)，米酒曲中乳酸菌和酵母菌的菌群主要為P.pentosaceus和S.fibuligera。由此可見，建始地區(qū)米酒曲含有大量的共生菌群，其在含有豐富乳酸菌和酵母菌資源的同時亦存在一定的條件致病菌，因而后續(xù)研究中開展米酒曲源有益菌株的收集保藏對米酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的推動作用。