付 金，姚秋萍，鄧水秀，譚承建

(貴州民族大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，貴州貴陽550025)

皂角米又稱皂角仁、皂角精，是皂莢的種子，含有半乳甘露聚糖［1］，是一種高蛋白、低糖、氨基酸齊全和礦質(zhì)元素豐富，符合高K低Na飲食結(jié)構(gòu)的營養(yǎng)保健食物［2］。此外，皂角還有一定的生物活性。如抗菌活性、殺蟲活性、抗病毒活性等［3］。楊向穎等［4］從皂莢中分離出一種具有殺鼠活性的三萜皂苷。Dai等［5］發(fā)現(xiàn)皂角70%乙醇提取物具有抗過敏和抗炎活性。Peng等［6］研究皂角果提取物，發(fā)現(xiàn)其可以通過抗高血脂活性有效地減輕動脈粥樣硬化，具有治療高脂血癥相關(guān)的心血管疾病的治療潛力。

近年來，皂角多糖資源的開發(fā)利用受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注，余銘等［7］用皂角米多糖溶液涂膜對比PE膜包裝處理對甜柿果果仁貯藏保鮮效果的研究發(fā)現(xiàn)，皂角米多糖具有類似PE膜包裝的保鮮效果，可作為一種新型的果實涂膜保鮮材料。Gao等［8］用皂角米多糖合成熱敏接枝聚合物，并對其進行結(jié)構(gòu)表征。Hou等［9］通過美拉德反應(yīng)，用酶蛋白疏水肽對皂角多糖進行疏水改性，制備了一種新型的皂角膠基乳化劑。Pradeep等［10］報道了皂角多糖具有抗大鼠糖尿病及其并發(fā)癥的作用。Sun等［11］報道了皂角米多糖能有效降低淀粉的消化率和葡萄糖擴散速率，通過體內(nèi)實驗證實皂角米多糖可以降低含淀粉食品的升糖指數(shù)，并抑制餐后血糖水平的激增。皂角米多糖因具有增稠、黏合、穩(wěn)定等特點在食品醫(yī)藥［12］、石油鉆探［13］、造紙［14］、涂料［15］等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。多糖作為皂莢的功能性成分之一，其提取工藝以及動力學(xué)研究在工業(yè)生產(chǎn)中尤為重要。目前已報道的皂角米多糖提取方法主要有水提醇沉、超聲波輔助提取等［16］，對于提取采用動力學(xué)模型方面的研究未見報道。

本實驗以貴州省畢節(jié)地區(qū)的皂角米為研究對象，采用Fick第一定律建立黔產(chǎn)皂角米多糖提取動力學(xué)模型，通過紅外分析對其結(jié)構(gòu)進行表征，通過測定皂角米多糖對2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)、羥基自由基、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、超氧陰離子自由基的清除能力來評價其抗氧化活性，以期為皂角米多糖的規(guī)?；崛∫约霸砬v高價值產(chǎn)品研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皂角米 購于貴州畢節(jié);苯酚、葡萄糖、過氧化氫、抗壞血酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、硫酸等 均為分析純;2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司;中性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司。

JA5003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;RE－2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TDL－8M離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;FD5－3P真空冷凍干燥機 美國SIM;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀 上海萊睿科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 皂角米多糖提取 將皂角米粉碎，過60目篩，精確稱量5.00 g于燒杯中，加入比例為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的蒸餾水，再加入2.50 g中性蛋白酶(蛋白酶活力50000 U/g)，攪拌均勻，室溫過夜，在328、333、338、343、348、353 K下回流60、75、90、105、120、135 min，抽濾，上清液加入200 mL無水乙醇，4℃靜置過夜，4000 r/min離心獲得沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，于－52℃下冷凍干燥24 h，即得皂角米多糖。

1.2.2 皂角米多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法［17］測定皂角米多糖含量。配制濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，精密量取葡糖糖標準溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于10 mL試管中，用蒸餾水補充至2 mL，沿管壁加入濃度為5%苯酚溶液1 mL，再加入5 mL濃硫酸，充分振搖，水浴10 min，靜置至室溫，于490 nm波長下測定吸光度值，作皂角米多糖濃度對吸光度關(guān)系圖。得到回歸方程為:y=6.05x－0.0903，線性范圍0.05～0.25 mg/mL，決定系數(shù)R2為0.9989。量取0.1 mL皂角米多糖溶液，按照上述方法操作，以下式計算多糖含量。

其中，C為樣品溶液中多糖濃度(mg/mL);V為樣品溶液體積(mL);F為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 多糖提取動力學(xué)研究 一般認為，多糖在提取過程中分為三個過程，提取液向物料內(nèi)部滲透［18］、有效成分溶解于提取液中［19］、有效成分向皂角米表面擴散以及由皂角米表面擴散至主體溶劑中［20］。假設(shè)粉碎后皂角米顆粒為球形，且形狀均勻［21］，整個提取過程中形態(tài)不變，多糖成分只向同一方向擴散，擴散系數(shù)恒定且均相溫度保持不變［22］。設(shè)皂角米顆粒半徑為R，表面擴散系數(shù)為Ds，由Fick第一定律得:

設(shè)提取接近平衡時提取溶液中多糖濃度為C∞，提取溶液中皂角米多糖初始濃度為C0，根據(jù)傅里葉變換求得［23］:

通常情況下，濃度的分布式為無限級數(shù)，高次項分布趨近于0，可忽略，上式取n=1，則

式(4)左右兩邊同時取對數(shù)得:

式(4)、(5)為皂角米多糖提取動力學(xué)模型，該模型反映了皂角米多糖提取過程中提取時間、提取溫度、料液比等參數(shù)對多糖濃度的影響。

1.2.4 皂角米多糖紅外光譜分析 稱取3 mg皂角米多糖與干燥的0.3 g KBr在瑪瑙研磨缽中順時針研磨2 min，壓為薄片，于紅外光譜儀中進行光譜掃描，波數(shù)范圍為4000～400 cm－1［24］。

1.2.5 皂角米多糖抗氧化活性研究

1.2.5.1 皂角米多糖對ABTS陽離子自由基的清除活性 參照Durmaz等［25］報道的方法制備ABTS樣液，取過硫酸鉀(2.6 mmol/L)于2 mL ABTS(7.4 mmol/L)中，混勻，室溫避光靜置12 h，取5 mL上述樣液于10 mL容量瓶中，分別加入一定濃度(0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)的皂角米多糖溶液，室溫避光靜置20 min，于752 nm測定吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對照。計算公式為:

式中，A0為空白對照組，A1樣品組。

1.2.5.2 皂角米多糖對羥基自由基的清除活性 參照李粉玲等［26］報道的方法，配制0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL的皂角米多糖溶液。取以上溶液各1 mL，加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸－乙醇1 mL，再加入8.8 mol/L H2O21 mL啟動反應(yīng)，37℃水浴30 min，在510 nm處測量吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對照。計算公式為:

式中，A0為空白對照液的吸光度值;AX為加入多糖后的吸光度值;AX0為不加過氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

1.2.5.3 皂角米多糖對DPPH自由基的清除活性 參照李亞輝等［27］的方法，取5 mL濃度為5 mmol/L的DPPH－無水乙醇溶液(備用液)，加入到不同濃度的多糖(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)溶液中，振搖，室溫暗處放置30 min，于517 nm測定吸光度，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對照。計算公式為:

式中，A0為備用液的吸光度，A1為備用液和多糖的吸光度，A2為無水乙醇和多糖吸光度。

1.2.5.4 皂角米多糖對超氧陰離子自由基的清除活性 參考羅敬文等［28］報道的方法，取1 mL去離子水于50 mmol/L Tris－HCl緩沖液中，混合均勻，水浴(25℃)20 min，加入1.0 mL不同濃度的多糖(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)與6 mmol/L 25℃預(yù)熱的鄰苯三酚0.1 mL，振搖混勻，水浴(25℃)5 min，加入0.5 mL 10 mmol/L HCl終止反應(yīng)。于420 nm處測定吸光值，以VC(濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5 mg/mL)作為對照。計算公式為:

式中，K0為空白樣品的平均吸光度值，K1為式樣的平均吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。用Graph Pad Prism 8.0.1(244)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取動力學(xué)模型的建立

2.1.1 提取速率常數(shù)k 由圖1可看出，皂角米多糖濃度和提取溫度、提取時間成正比關(guān)系。當(dāng)提取時間達到120 min后，多糖濃度變化較小，135 min后基本平衡;相同的提取時間下，提取溫度越高，多糖濃度越大;相同提取溫度下，提取時間越長，析出的多糖越多，濃度越大。由圖2可看出，相同提取時間條件下，料液比越大，則多糖濃度越大，一定范圍內(nèi)，增大料液比有助于多糖提取;相同料液比條件下，提取時間越長，多糖濃度越大，一定范圍內(nèi)，升高溫度有助于多糖提取。相同料液比條件下，當(dāng)提取時間達120 min后，多糖濃度變化較小，135 min時基本達到平衡。在溫度為353 K，提取時間為135 min時，皂角米多糖得率為7.1%。

圖1 不同溫度條件下多糖濃度隨時間變化趨勢Fig.1 Changes of polysaccharide concentration with time under different temperature conditions

圖2 不同料液比條件下多糖濃度隨時間變化趨勢Fig.2 Variation of polysaccharide concentration with time under different material－liquid ratios

利用圖1、圖2中的變化趨勢作ln［C∞/(C∞－C)］對t的關(guān)系圖，見圖3，所得的關(guān)系曲線和表觀速率常數(shù)k見表1、表2。

由表1、表2得出，不同提取條件下的ln［C∞/(C∞－C)］與t線性關(guān)系良好，系數(shù)R2均大于0.90。表觀速率常數(shù)k與提取時間和料液比成正比。

2.1.2 相對萃余率 皂角米在提取前雖浸泡，但其溶于水中的多糖較少，可忽略。取初始濃度C0=0，設(shè)相對萃余率y=(C∞－C)/C∞，則式(5)變?yōu)閥=(6/π2)exp(－kt)。在圖1、圖2數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作相對萃余率(C∞－C)/C∞對提取時間t關(guān)系圖(圖4)。

表1 不同提取溫度下ln［C∞/(C∞－C)］與時間t的回歸結(jié)果Table 1 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different temperatures

表2 不同料液比時ln［C∞/(C∞－C)］與時間t的回歸結(jié)果Table 2 Regression results between ln［C∞/(C∞－C)］and t at different solid－liquid ratios

擬合方程和速率常數(shù)見表3、表4。由表3、表4看出，擬合方程系數(shù)均在0.88以上，擬合度較好，符合指數(shù)模型。

2.1.3 活化能 由化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)可知，在皂角米多糖提取過程中，其速率常數(shù)k與溫度T符合符合Arrhenius公式［29］:lnk=lnA－Ea/RT。用圖1、表1中的數(shù)據(jù)作lnk與T關(guān)系圖(見圖5)，由圖可知，lnk與T線性關(guān)系較好(R2=0.9892)。根據(jù)回歸方程計算出皂角米多糖水提過程中的活化能Ea=1807×8.314=15.023 kJ/mol。

圖4 不同提取條件下(C∞－C)/C∞與時間的關(guān)系Fig.4 The relationship between relative extraction rate and time under different extraction conditions

表3 不同溫度下多糖相對萃余率對時間的回歸結(jié)果Table 3 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio and time at different temperatures

2.1.4 半衰期 由t1/2對溫度T作圖，見圖6。通過此公式可計算出提取一半皂角米多糖所需的時間。由圖6可知，半衰期和溫度曲線擬合較好(R2=0.9868)。半衰期反映了提取的效率，其數(shù)值與提取速率成反比，數(shù)值越小，提取速率越快。在一定溫度范圍內(nèi)，半衰期與溫度成反比。即提取溫度升高，半衰期減小，升高溫度有利于皂角米多糖提取。

表4 不同料液比下多糖相對萃余率對時間的回歸結(jié)果Table 4 Regression results of polysaccharide relative raffinate ratio with time under different material－liquid ratios

圖5 皂角米多糖lnk與1/T關(guān)系圖Fig.5 Relationship between lnk and 1/T of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

圖6 皂角米多糖t1/2與溫度關(guān)系圖Fig.6 Relationship between t1/2 and temperature of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.2 紅外光譜分析

3422 cm－1出現(xiàn)的是O－H振動峰，峰形飽滿，有分子內(nèi)或分子間氫鍵存在［30］;2923 cm－1是C－H伸縮振動引起，是多糖的特征吸收峰［31］。1638 cm－1為糖環(huán)上C=O不對稱收縮引起的振動峰，1384 cm－1為C－H彎曲振動峰;1010～1100 cm－1附近出現(xiàn)三個吸收峰(1151、1078、1027)為C－O伸縮振動峰，是吡喃糖苷的特征吸收峰，表明皂角米多糖中含有吡喃糖環(huán)［32］;871 cm－1為次甲基振動，表明含有β－型糖苷鍵［33］。808 cm－1處為甘露糖的特征吸收峰，524 cm－1處為羰基振動變形［34］。

2.3 皂角米多糖抗氧化活性研究

圖7 皂角米多糖紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrum of polysaccharide from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.1 皂角米多糖對ABTS陽離子自由基的清除能力 從圖8可知，在濃度范圍內(nèi)，皂角米多糖對ABTS陽離子自由基的清除能力隨濃度的升高而增大。荷葉離褶傘多糖也具有同樣的清除作用，但清除能力不及皂角米多糖［35］。當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL，皂角米多糖和VC對ABTS陽離子自由基的清除能力相差不大;但當(dāng)濃度大于0.75 mg/mL時，VC的清除能力明顯高于皂角米多糖，并且皂角米多糖的清除能力隨著濃度升高趨于變緩。當(dāng)濃度為5 mg/mL時，皂角米多糖對ABTS陽離子自由基的清除率達71.82%，IC50為0.072 mg/mL。

圖8 皂角米多糖對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.8 ABTSfree radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.2 皂角米多糖對羥基自由基的清除能力 從圖9可知，當(dāng)濃度小于1 mg/mL時，皂角米多糖和VC對羥基自由基的清除率隨濃度的升高快速增加;吳金松等［36］研究鐵觀音茶末多糖抗氧化活性實驗中也表明了羥基自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度有關(guān)。當(dāng)濃度大于1 mg/mL時，皂角米多糖和VC對羥基自由基的清除率趨于穩(wěn)定。在濃度范圍內(nèi)，VC對羥基自由基的清除率均大于皂角米多糖。當(dāng)濃度為5 mg/mL時，皂角米多糖對羥基自由基清除率達83.36%，IC50為0.659 mg/mL。

2.3.3 皂角米多糖對DPPH自由基的清除能力 從圖10可知，皂角米多糖和VC對DPPH自由基的清除能力隨濃度的升高而增強，與余騰飛等［37］在研究憂遁草多糖對DPPH自由基清除能力的結(jié)論一致。在濃度范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除能力均大于皂角米多糖，但兩者的清除率相差不大。當(dāng)濃度為5 mg/mL時，皂角米多糖對DPPH自由基的清除率為84.00%，IC50為0.722 mg/mL。

圖9 皂角米多糖對羥基自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of hydroxyl radicals by polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

圖10 皂角米多糖對DPPH自由基清除率Fig.10 DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis

2.3.4 皂角米多糖對超氧陰離子自由基的清除能力 從圖11可知，在濃度范圍內(nèi)，隨皂角米多糖濃度的升高，對超氧陰離子自由基的清除能力上升比較平緩，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度小于1 mg/mL，VC對超氧陰離子自由基清除率隨濃度升高而顯著增強，與陸海勤等［37］研究黃花菜多糖對超氧陰離子自由基清除能力的結(jié)論一致。當(dāng)濃度大于1 mg/mL時，清除率趨于穩(wěn)定。當(dāng)濃度為5 mg/mL時，皂角米多糖對超氧陰離子自由基的清除率達86.11%，IC50為1.052 mg/mL。

圖11 皂角米多糖對超氧陰離子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of polysaccharides from seeds of Gleditsia sinensis to superoxide anion free radicals

3 結(jié)論

以Fick第一定律為基礎(chǔ)，以皂角米為研究對象，用熱水浸提的方式建立了皂角米多糖提取動力學(xué)模型，通過該模型可求得不同提取溫度及不同料液比條件下的相關(guān)參數(shù):表觀速率常數(shù)k、相對萃余率(C∞－C)/C∞、半衰期t1/2、活化能Ea等。該模型計算值與實際測得數(shù)據(jù)吻合良好，計算結(jié)果表明，ln［C∞/(C∞－C)］與t線性關(guān)系較好，關(guān)系系數(shù)均大于0.9;活化能Ea為15.023 kJ/mol，在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度，有利于皂角米多糖的提取。通過紅外光譜分析，皂角米多糖含有甘露糖，有吡喃糖環(huán)，為β型。皂角米多糖對ABTS陽離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率分別為:71.82%、83.36%、84.00%、86.11%，表明皂角米多糖具有一定的抗氧化活性。