趙海燕 劉 楠 房文文 杜勝利 崔洪宇

（天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300192）

黃瓜（Cucumis sativus L.）為葫蘆科黃瓜屬植物，在我國(guó)被廣泛種植，是大眾餐桌上的主要蔬菜之一。黃瓜種子品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著黃瓜的品質(zhì)與產(chǎn)量[1-3]。 黃瓜種子的純度通常受制種基地隔離措施、制種戶對(duì)制種規(guī)程的執(zhí)行力等綜合因素的共同影響。隨著我國(guó)黃瓜種業(yè)市場(chǎng)化程度日益提高，使得快速、有效地鑒別雙親、混雜品種和真實(shí)雜交種成為必然。以往常規(guī)的田間純度鑒定主要是形態(tài)鑒定法， 很大程度上依賴于育種家對(duì)種子、幼苗、成年植株、葉、花、花粉、果實(shí)等器官的顏色、刺瘤、瓜把等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀察指標(biāo)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、方便、直觀，但鑒定周期長(zhǎng)、工作量大，容易受季節(jié)、栽培措施及環(huán)境因素的限制，往往準(zhǔn)確度欠佳。 品種的純度和真?zhèn)舞b定本質(zhì)上是對(duì)其基因型的鑒定, 田間形態(tài)學(xué)鑒定尤其是對(duì)親緣關(guān)系較近的品種往往很難區(qū)分， 而且有的新品種本身就缺乏可供鑒定的新農(nóng)藝性狀，另外還要求鑒定者對(duì)品種的特征非常熟悉，具有一定的工作經(jīng)驗(yàn)。 上述的諸多問題均可能影響后期品種純度鑒定的準(zhǔn)確程度， 進(jìn)而也給后期良種的推廣使用造成影響， 因此采用更為合理高效的檢測(cè)方法十分必要[1,4-6]。

隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，使品種純度鑒定有了良好的技術(shù)平臺(tái)和更為適合的技術(shù)手段。DNA 在生物體各組織、各發(fā)育階段均可檢測(cè)到，并且可以在種子發(fā)育后的各個(gè)時(shí)期、各個(gè)階段采集樣本，因此其具有標(biāo)記可遍布整個(gè)基因組、無(wú)組織特異性、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)， 而且其遺傳穩(wěn)定性好。SSR 標(biāo)記，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，具有數(shù)量豐富、在基因組中分布均勻、多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又因SSR 引物共顯性的特點(diǎn)在雜交種純度鑒定具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]，非常適合于高通量分析[5,7]。SSR 分子標(biāo)記已經(jīng)大規(guī)模的成熟應(yīng)用于黃瓜品種純度鑒定， 同時(shí)也已廣泛應(yīng)用于茄子[8-9]、油菜[10]、甘藍(lán)[11]、甜瓜[7]等蔬菜作物雜交種純度鑒定中。

本文作者利用SSR 標(biāo)記對(duì)天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所育成的黃瓜新品種‘科潤(rùn)99’及其父、母本的種子純度進(jìn)行鑒定，旨在為‘科潤(rùn)99’種子純度鑒定提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘科潤(rùn)99’黃瓜雜交種及其父、母本，由天津科潤(rùn)黃瓜研究所生物技術(shù)室提供。

1.2 DNA 提取

本試驗(yàn)采用CTAB 法提取黃瓜基因組DNA，方法同崔興華等（2015）。

1.3 特異引物篩選

以上述提取的DNA 為模板， 165 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 選取父本、 母本、 F1各 2 粒， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8% PAGE 凝膠電泳、 染色、 顯色后進(jìn)行分析，依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置進(jìn)行試驗(yàn)分析。 試驗(yàn)結(jié)果中選取雜交種和父母本間存在共顯性分離的引物， 對(duì)比分析從而應(yīng)用于該品種的純度檢測(cè)。

PCR 采用 10 μL 擴(kuò)增體系： 模板 DNA10 ng、上游引物和下游引物各25 ng、2×Taq PCR Master Mix（包含 Taq、Buffer、Mg2+、dNTP）5.0 μL，3.96 μL 滅菌去離子水。

擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 300 s，95℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 60 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸350 s。

1.4 特異引物的驗(yàn)證

試驗(yàn)時(shí)間為2019 年4～12 月。 在試驗(yàn)田中隨機(jī)選取220 株‘科潤(rùn)99’黃瓜植株進(jìn)行田間生物學(xué)性狀觀察， 同時(shí)于實(shí)驗(yàn)室中提取對(duì)應(yīng)植株的DNA 進(jìn)行SSR 擴(kuò)增， 將田間純度鑒定結(jié)果與SSR 分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析， 從而驗(yàn)證篩選到的引物對(duì)‘科潤(rùn)99’種子純度鑒定的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘科潤(rùn)99’特異引物篩選

選用165 對(duì) SSR 引物在‘科潤(rùn) 99’及父、母本間進(jìn)行特異譜帶的篩選，通過(guò)PCR 擴(kuò)增及電泳分離，有10 對(duì)引物在親本間表現(xiàn)為共顯性分離（圖1），‘科潤(rùn)99’表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)帶型。

圖1 科潤(rùn)99 部分引物篩選圖譜

2.2 ‘科潤(rùn)99’特異引物純度鑒定的驗(yàn)證

將初步篩選出的10 對(duì)SSR 引物，再次對(duì)田間所栽培的220 株 ‘科潤(rùn)99’ 黃瓜植株進(jìn)行SSR 純度鑒定，觀察試驗(yàn)結(jié)果，從而對(duì)所選出的引物是否可以鑒定 ‘科潤(rùn)99’種子純度進(jìn)行評(píng)估、驗(yàn)證。 試驗(yàn)結(jié)果表明（附表、圖2、圖3），10 對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶中‘科潤(rùn)99’的條帶均為父、母本互補(bǔ)帶型，與上述篩選結(jié)果表現(xiàn)一致。 其中引物N216 和N221 不純種子的檢出率分別為2.27%和1.82%，田間鑒定不純率為2.73%， 二者純合種子的符合率在99.0%以上，并且這兩對(duì)引物擴(kuò)增的條帶清晰、 帶型整齊， 特異性強(qiáng)。由此可見，這兩對(duì)SSR 標(biāo)記可以作為‘科潤(rùn)99’種子純度鑒定的特異分子標(biāo)記，從而用于純度檢測(cè)。 同時(shí)也表明在SSR 分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)果的可靠性、 準(zhǔn)確性，決定其可以對(duì)黃瓜品種進(jìn)行純度鑒定。

圖2 引物N216 對(duì)科潤(rùn)99 及其親本擴(kuò)增圖譜

圖3 引物N221 對(duì)科潤(rùn)99 及其親本擴(kuò)增圖譜

附表 SSR 分子標(biāo)記鑒定與田間鑒定比較

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，165 對(duì)SSR 引物中篩選出在 ‘科潤(rùn)99’ 的親本間表現(xiàn)較好的多態(tài)性的引物有10 對(duì)。其中N216 和N221 這兩對(duì)引物在試驗(yàn)中表現(xiàn)更為優(yōu)秀，試驗(yàn)結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這兩對(duì)SSR 引物與田間純度鑒定結(jié)果高度吻合，二者符合率在 99.0%以上。 因此，SSR 標(biāo)記 N216 和 N221 的室內(nèi)分子檢測(cè)方法可以應(yīng)用于替代田間‘科潤(rùn)99’黃瓜種子的純度鑒定，成功的解決了田間鑒定周期長(zhǎng)、容易受環(huán)境條件等影響的問題，同時(shí)也降低了財(cái)力、物力和人力消耗。

近年來(lái)天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所已將SSR 技術(shù)熟練地應(yīng)用于本單位多個(gè)黃瓜雜交種的純度鑒定， 從而保證本公司的產(chǎn)品可以及時(shí)的投入市場(chǎng)。 每一個(gè)品種在基因型上都是非常穩(wěn)定的， 以此為基礎(chǔ)即可使用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)出某些位點(diǎn)的純度， 當(dāng)某一品種種子中混入其親本自交種或其他品種種子時(shí)，SSR 分子標(biāo)記通過(guò)檢測(cè)該樣品植株間基因型的差異，即可分辨出來(lái)。 通常對(duì)于母本自交的種子，可以采用單引物檢測(cè)方法，即可把其雜交種和其父母本雜株區(qū)別開來(lái)。 但如果檢測(cè)樣品存在異源花粉的F1或機(jī)械混雜種子時(shí)， 即需要采用多對(duì)SSR 引物同時(shí)對(duì)該樣品進(jìn)行檢測(cè)， 從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。