高 安，徐玉靜，陸圣威，孫 蔚，甘建和

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 感染科，江蘇 蘇州 215000

慢加急性肝衰竭(ACLF)為慢性肝病基礎(chǔ)上，短期內(nèi)出現(xiàn)急性肝功能失代償和肝衰竭的表現(xiàn)[1]。ACLF會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、腸屏障功能受損、免疫功能下降[2]，越來越多的證據(jù)[3]說明慢性肝病與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。近年來，腸道菌群在人體健康和疾病中起著至關(guān)重要的作用，并參與腸道內(nèi)外慢性疾病的病理生理學(xué)[4]。基于腸肝軸理論，推測改善菌群失調(diào)對ACLF有保護(hù)意義，本實(shí)驗(yàn)通過建立ACLF小鼠模型，研究ACLF小鼠腸道菌群變化及糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)對ACLF小鼠的安全性及保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用40只SPF級雄性C57BL/6小鼠，3～4周齡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(蘇)2018-0006。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)為SYXK(蘇)2017-0042。實(shí)驗(yàn)墊料、飼料經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，符合SPF級動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)，溫度(24±2) ℃，濕度55%，小鼠自由攝取飼料和飲用水，光照與黑暗各12 h循環(huán)。

1.2 主要試劑 CCl4購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，橄欖油購自國藥試劑網(wǎng)，D-氨基半乳糖(D-GalN)與脂多糖(LPS) 購自美國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ACLF小鼠模型建立 將40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組10只。本研究采用CCl4聯(lián)合D-GalN和LPS建立ACLF模型[5-6]。正常組(CON組)作為正常對照組進(jìn)行觀察。模型組(MOD組)小鼠按5 ml/kg腹腔注射20% CCl4(橄欖油稀釋) ，2次/周，共12周，10 d后給予一次性腹腔聯(lián)合注射(LPS 0.5 mg/kg、D-Gal 400 mg/kg)，建立ACLF模型，48 h后處死。糞菌移植組(FMT組)小鼠造模同MOD組，在第12周予以制備的正常組(CON組)小鼠糞菌液200 μl/只灌胃，持續(xù)3 d。模型小鼠糞菌移植組(ANFMT組)小鼠，在第12周予以制備的模型組(MOD組)小鼠糞菌液200 μl/只灌胃，持續(xù)3 d外。CON組小鼠給予腹腔注射同等劑量的橄欖油、生理鹽水，同等劑量生理鹽水灌胃。MOD組予以同等劑量生理鹽水灌胃。4組小鼠同時(shí)處死。

1.3.2 標(biāo)本采集與糞菌液制作 糞便標(biāo)本采集采用刺激小鼠肛門的方法收集新鮮排出的小鼠糞便裝于EP管中，裝好的標(biāo)本迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存。稱重后用無水乙醚麻醉，眼球取血放入采血管(含有肝素鋰)，1500 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。眼球取血后的小鼠頸椎脫臼處死后解剖，取出肝臟，每只小鼠在肝右葉同一位置切取2塊0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm大小肝組織，放進(jìn)10%福爾馬林溶液，用于病理檢測。

參照相關(guān)文獻(xiàn)制備糞菌液[7-8]，具體步驟如下：(1)分別選取CON組和MOD組小鼠糞便；(2)稀釋，糞便稱重后放于攪拌器中，加入5倍糞便重量的無菌生理鹽水進(jìn)行攪拌混勻；(3)過濾,將糞便混懸液先后經(jīng)過直徑約1、0.5、0.25 mm的自制滅菌不銹鋼濾網(wǎng)過濾；(4)離心,將懸液用15 ml離心管分裝置于離心機(jī)中(2000 r/min、5 min)，棄上清液；(5)洗滌,將菌液加生理鹽水至原懸液的量并搖勻，再次離心(2000 r/min、5 min)重復(fù)3次；(6)凍存。按照50 ml菌液加甘油(100%)5 ml的比例搖勻，分裝于2 ml凍存管中，放入-80 ℃冰箱。

1.4 各項(xiàng)指標(biāo)檢測 肝功能指標(biāo)：采用全自動(dòng)生化儀檢測ALT、AST水平。病理HE染色：肝組織在10%福爾馬林溶液中固定1 d后取出，進(jìn)行梯度濃度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，并包埋在石蠟里，行組織切片及HE染色，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照、保存。糞便腸道菌群檢測：糞便樣品按照試劑盒說明書提取DNA，將DNA樣品在Illumina NovaSeq平臺(tái)對小鼠糞便腸道菌群進(jìn)行高通量測序，獲得16SrDNA數(shù)據(jù)。構(gòu)建類OTU( Operational Taxonomic Units)表，獲得最終的feature特征表以及特征序列，進(jìn)一步進(jìn)行Venn圖、α多樣性分析、β多樣性分析、觀察在門、屬水平相對豐度較高的物種并進(jìn)行差異分析等。

1.5 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：SUDA20201208A03，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量和肝功能的變化 4組小鼠體質(zhì)量變化如圖1所示，在進(jìn)行糞菌灌胃3 d內(nèi)，ANFMT組與FMT組小鼠體質(zhì)量均下降。與CON組相比，MOD組小鼠體質(zhì)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MOD組與FMT組在CCl4腹腔注射及灌糞菌液期間均未出現(xiàn)小鼠死亡，在末次聯(lián)合注射LPS與D-GalN，MOD組死亡4只，F(xiàn)MT組死亡2只，2組病死率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與CON組相比，ANFMT組、MOD組、FMT組AST水平均顯著升高(P值均<0.05)，MOD組ALT水平顯著升高(P<0.05)。與MOD組相比，F(xiàn)MT組AST、ALT均顯著下降(P<0.05)(表1)。

表1 4組小鼠體質(zhì)量與肝功能水平比較

圖1 4組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 小鼠肝組織病理結(jié)果 如圖2所示，CON組小鼠肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無變性、壞死，無炎性細(xì)胞浸潤；MOD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，排列紊亂，肝細(xì)胞大片狀壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤；與CON組相比，ANFMT組肝細(xì)胞腫脹，輕微氣球樣變，炎性浸潤增多；FMT組彌漫性肝細(xì)胞腫脹，明顯氣球樣變、壞死輕于MOD組。

注：a，CON組；b，ANFMT組；c，MOD組；d，F(xiàn)MT組。圖2 各組小鼠肝組織病理(HE染色，×200)

2.3 測序結(jié)果質(zhì)量分析

2.3.1 feature分布Venn圖 基于各組樣本的OTU數(shù)量繪制了可直觀顯示差異的Venn圖。CON組有525個(gè)獨(dú)有的OTU，ANFMT組有718個(gè)獨(dú)有的OTU，MOD組有1360個(gè)獨(dú)有的OTU，F(xiàn)MT組有991個(gè)獨(dú)有的OTU(圖3a)。與CON組相比，MOD組有1701個(gè)獨(dú)有的OTU，ANFMT組有992個(gè)獨(dú)有的OTU，F(xiàn)MT組有1331個(gè)獨(dú)有的OTU(圖3b～d)。

2.3.2 α多樣性分析 各樣本稀釋曲線均趨于平坦(圖4)，表明本實(shí)驗(yàn)取樣量合理且物種組成豐富度高，可進(jìn)一步分析。α多樣性分析中observed_OTUs指數(shù)(χ2=1.42，P=0.70)、Shannon指數(shù)(χ2=1.71，P=0.63)、Simpson指數(shù)(χ2=1.25，P=0.74)在各組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 β多樣性分析 主成分分析(PCA)表明，與CON組相比，MOD組、FMT組、ANFMT組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化(P<0.01)(圖5)?；赪eighted_UniFrac NMDS分析顯示，4組腸道菌群存在差異(P<0.01)(圖6)。主坐標(biāo)分析(PCoA分析)顯示，4組各樣本間距離較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖7)?；赪eighted_Unifrac anosiom相似性分析：R=0.286，P=0.001；基于Weighted_Unifrac adonis多元分析：R2=0.263，P=0.02，表明組間差異大于組內(nèi)差異，4個(gè)不同分組樣品存在差異，可信度高。

注： a，4組比較；b，CON組 vs ANFMT組；c，CON組 vs MOD組；d，CON組 vs FMT組。

圖4 各組糞便菌群稀釋曲線圖

圖5 4組腸道菌群PCA分析

圖6 4組腸道菌群NMDS分析

注： a，基于unweighted unifrac分析；b，基于 weighted unifrac分析。圖7 4組腸道菌群PCoA分析

2.3.4 小鼠腸道菌群物種組成分析

2.3.4.1 門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 基于門水平樣本物種組成結(jié)構(gòu)和差異性聚類分析發(fā)現(xiàn)，小鼠糞便菌群組成以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Fimicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)為主，Bacteroidetes和Fimicutes為主要優(yōu)勢菌群(圖8a)。在柱狀圖的基礎(chǔ)上，還可以根據(jù)樣品物種組成距離對樣品進(jìn)行聚類分析，采用Bray-Curtis距離，ANFMT組各菌門豐度雖與CON組相近，但菌門平均豐度上升或下降與MOD組相似；FMT組菌群較MOD組有一定程度的恢復(fù)(圖8b)。對同一生物學(xué)重復(fù)組內(nèi)取均值進(jìn)行熱圖繪制(圖9)，門水平差異檢驗(yàn)顯示，與CON組相比，MOD組小鼠Verrucomicrobia上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CON組相比，ANFMT組小鼠未分類(unclassified)升高，Patescibacteria、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；與MOD組相比，F(xiàn)MT組小鼠厚壁菌門(Fimicutes)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注： a，門水平柱狀圖; b，樣品聚類分析圖。圖8 四組菌群門水平分布情況

注：與CON組相比，*P<0.05；與MOD組相比，#P<0.05；藍(lán)色表示豐度低，紅色表示豐度高。

2.3.4.2 屬水平腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 各組菌群菌屬相對豐度上存在明顯差異，且優(yōu)勢菌群發(fā)生變化。CON組中Muribaculaceae_unclassified、Dubosiella在腸道菌群中占比最高，MOD組中，Muribaculaceae_unclassified、鏈球菌屬(Streptococcus)阿克曼菌屬(Akkermansia)在腸道菌群中占比最高(圖10a)。聚類分析顯示，ANFMT組在菌屬水平豐度雖與CON組相近，各菌屬豐度變化較MOD組菌屬變化相似；FMT組菌群與MOD組比有一定程度的恢復(fù)(圖10b)。對同一生物學(xué)重復(fù)組內(nèi)取均值進(jìn)行熱圖繪制(圖11)，屬水平差異檢驗(yàn)顯示，與CON組相比，ANFMT組小鼠unclassified、Faecalibaculum上升，Muribaculum、Candidatus_Saccharimonas、理研菌屬(Rikenella)、Odoribacter、Mucispirillum、Lachnospiraceae_unclassified下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與CON組相比，MOD組小鼠Akkermansia屬、Erysipelatoclostridium上升，Dubosiella、Duncaniella下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與MOD組相比，F(xiàn)MT組小鼠Paramuribaculum、嗜膽菌屬(Bilophila)上升，Rikenella、Absiella下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

2.3.5 各組菌群差異 LEfSe(LDA Effect Size)差異分析旨在找到不同組間豐度上有顯著性差異的物種。根據(jù)LDA值大小(LDA>4)，在門屬水平上，MOD組中Fimicutes占優(yōu)勢；ANFMT組中Dubosiella占優(yōu)勢，CON組中奈瑟菌屬(Neisseria)占優(yōu)勢(圖12)。

注： a，屬水平柱狀圖；b，樣品聚類分析圖。圖10 四組菌群屬水平分布情況

注：與CON組相比，*P<0.05；與MOD組相比，#P<0.05。

3 討論

腸道微生物群定居于人類腸道，腸道細(xì)菌數(shù)量超過100萬億，其復(fù)雜基因組比人類基因組多150倍[9]。腸肝軸為腸道與肝臟之間形成解剖和功能上的緊密聯(lián)系。一方面細(xì)菌或代謝物進(jìn)入門靜脈血循環(huán)，與免疫細(xì)胞相互作用，到達(dá)肝臟微循環(huán)，與非實(shí)質(zhì)性和實(shí)質(zhì)性肝細(xì)胞相互作用。另一方面，肝臟還分泌膽汁酸，膽汁酸反過來改變腸道微生物群，同時(shí)也作為肝臟、腸道微生物群和腸道之間的信號(hào)分子[10]。

目前，ACLF仍有較高的發(fā)病率與病死率。肝硬化患者一旦發(fā)生急性失代償，15%的住院患者將進(jìn)一步發(fā)展為ACLF，其中40%將在90天內(nèi)死亡[11]。Qin等[10]認(rèn)為健康對照者相比，肝硬化患者腸道微生物擬桿菌門與厚壁菌門水平降低，而鏈球菌屬和韋榮球菌屬升高，微生物群的變化是隨著肝硬化的發(fā)展而發(fā)生的。最近Bajaj等[12]的研究證實(shí)了腸道微生物與肝硬化之間的聯(lián)系，該研究表明，在1例嚴(yán)重肝硬化患者肝移植后，腸道微生物的多樣性和共生性顯著提高。在另一篇文獻(xiàn)中，Bajaj等[13]研究認(rèn)為通過飲食獲得的不同腸道微生物與肝硬化的進(jìn)展和住院風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Chen等[2]發(fā)現(xiàn)腸道微生物組成變化與肝病的嚴(yán)重程度相關(guān)，與ACLF患者發(fā)病前相比，ACLF患者擬桿菌門、瘤胃菌科、紫單胞菌科、毛螺旋菌科水平下降，而厚壁菌門水平上升。有足夠的證據(jù)[14-16]表明，微生物群的變化會(huì)影響肝病的進(jìn)展。

由于人和鼠存在的異源性，本研究選取小鼠糞便作為糞菌群供體，而非人類糞便。結(jié)果顯示，在進(jìn)行糞菌移植時(shí)，F(xiàn)MT組與ANFMT組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)下降，可能與菌群定植反應(yīng)有關(guān)；與CON組小鼠相比，MOD組小鼠體質(zhì)量明顯下降，肝細(xì)胞大片壞死，造模成功。FMT組小鼠腸道菌群改善，體質(zhì)量恢復(fù)，ALT、AST明顯降低，肝細(xì)胞壞死減輕，從而進(jìn)一步說明了改善腸道菌群對ACLF小鼠具有保護(hù)作用。ANFMT組小鼠AST明顯升高，肝細(xì)胞輕微氣球樣變和炎性細(xì)胞浸潤，說明菌群紊亂導(dǎo)致肝損傷；而同時(shí)MOD組小鼠肝損傷引起菌群改變，可見肝臟與腸道菌群互為因果。

Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)因給予大腸桿菌、鼠傷寒上門氏菌和腸球菌出現(xiàn)菌群失調(diào)從而導(dǎo)致肝硬化大鼠細(xì)菌易位和AST水平顯著增高。LPS通過CD14、Toll-樣受體4、核因子κB和TNFα信號(hào)通路以及其他信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[18]。然而，LPS主要通過Kupffer細(xì)胞在肝臟中清除，因此肝衰竭直接導(dǎo)致的Kupffer細(xì)胞功能障礙可能導(dǎo)致血漿LPS異常。Kupffer細(xì)胞功能狀態(tài)與肝損傷程度之間存在相關(guān)性[19]。 當(dāng)肝功能受損時(shí)，持續(xù)的免疫激活、炎癥、Kupffer細(xì)胞功能受損和不受控制的內(nèi)毒素血癥可引起活性氧(ROS)刺激[20-21]。由于內(nèi)毒素血癥、免疫功能紊亂和Toll樣受體4介導(dǎo)的炎癥，導(dǎo)致腸道細(xì)菌過度生長[22]?？傊?，腸道菌群失調(diào)可通過以下機(jī)制加速ACLF的進(jìn)展[23-24]：(1)腸道通透性增加和腸道細(xì)菌易位增強(qiáng)；(2)菌群失調(diào)的微生物促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了黏膜損傷。雖然腸道微生物在ACLF的發(fā)病機(jī)制和并發(fā)癥中的作用尚不完全清楚，但這些發(fā)現(xiàn)為通過調(diào)節(jié)腸道微生物來治療ACLF提供了希望。

綜上所述，ACLF小鼠會(huì)出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，而FMT可以調(diào)節(jié)腸道菌群，減輕肝損傷，對ACLF小鼠具有保護(hù)作用。干擾正常小鼠的腸道微生態(tài)后，菌群失調(diào)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致肝損傷。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高安負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究，資料分析，撰寫論文；徐玉靜、陸圣威參與收集及分析數(shù)據(jù)；孫蔚負(fù)責(zé)擬定寫作思路，修改論文；甘建和負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。