趙佳男，彭景華，劉 平,2,3，胡義揚(yáng),2,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學(xué) 肝病研究所，上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；3 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 4 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 臨床藥理研究所，上海 201203

肝纖維化是指各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展時(shí)肝臟損傷修復(fù)愈合反應(yīng)的一種病理生理過程[1]，其中肝細(xì)胞凋亡在肝纖維化的形成過程中具有重要作用[2]。關(guān)于肝細(xì)胞凋亡與肝纖維化的聯(lián)系，目前主要有2種機(jī)制[3]：(1)肝細(xì)胞凋亡后產(chǎn)生的凋亡小體被肝臟中的Kupffer細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝竇周細(xì)胞吞噬，促進(jìn)纖維化進(jìn)展；(2)凋亡的肝細(xì)胞會(huì)釋放核苷酸腺苷三磷酸、脂質(zhì)溶血磷脂膽堿等促纖維化介質(zhì)從而促進(jìn)肝纖維化。

目前國內(nèi)已有多種中成藥應(yīng)用于肝纖維化的治療，如扶正化瘀膠囊、鱉甲軟肝片等。這些方藥中大多含有蟲草菌絲或冬蟲夏草。筆者在既往針對(duì)扶正化瘀膠囊有效組分的研究[4-6]中發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖具有顯著的抗肝纖維化作用，其可通過抑制肝星狀細(xì)胞活化和抑制TGFβ/Smads信號(hào)通路而發(fā)揮抗肝纖維化作用[7]，同時(shí)體內(nèi)研究[8]也發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖有抗肝細(xì)胞凋亡的作用，因此，本文擬運(yùn)用體外TNFα誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡模型，進(jìn)一步探討蟲草多糖對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞株L02，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 蟲草多糖(批號(hào)180316，純度≥45%UV)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，稱取0.028 g蟲草多糖，加入1 ml細(xì)胞全培養(yǎng)基后進(jìn)行冰水浴超聲5 min混勻，配置為12.8 mg/ml的蟲草多糖母液儲(chǔ)存在超低溫冰箱備用，后續(xù)根據(jù)所需實(shí)驗(yàn)藥物濃度進(jìn)行配置。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(1X，貨號(hào)11965-092，購自GibcoTM)；胎牛血清(貨號(hào)10099141C，購自GibcoTM)；青霉素和鏈霉素(10 000 U/ml，貨號(hào)15140122，購自GibcoTM)；PBS(貨號(hào)21-040-CV，購自Corning公司)；TNFα(貨號(hào)210-TA，購自美國R&D公司)；CCK8試劑盒(貨號(hào)CCK02-181102，購自上海博谷生物科技有限公司)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒[貨號(hào)E606336-0100，購自生工生物工程(上海)股份有限公司]；兔cleaved-caspase3單克隆抗體(貨號(hào)9664)和兔cleaved-caspase8單克隆抗體(貨號(hào)9496)均購自cell signaling technology公司；兔GAPDH多克隆抗體(貨號(hào)10494-1-AP，購自Proteintech公司)；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(貨號(hào)B511321-0100，購自生工生物工程上海股份有限公司)；TB Green Rremix Ex Taq(貨號(hào)PK0445，購自TaKaRa Bio公司)；iScriptTM cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)1708891，購自TaKaRa Bio公司)；RT-PCR使用引物以及片段長度詳見表1。

表1 引物序列及片段長度

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 細(xì)胞孵育箱(型號(hào)Galasxy170s，購于美國NewBrunswick公司)；細(xì)胞超凈操作臺(tái)(型號(hào)HR50-IIA2，購自中國海爾公司)； PCR機(jī)(型號(hào)Applied Biosystems ViiA7，購自美國賽默飛公司)； Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(購自Li-COR公司)；高內(nèi)涵系統(tǒng)(購自美國賽默飛公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02正常肝細(xì)胞在提前配置好的完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中添加1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清。于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 造模方法 將細(xì)胞按照所需組數(shù)接種于96孔板或6孔板，每孔細(xì)胞密度根據(jù)后續(xù)具體實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行選擇，TNFα造模濃度為0、5、10、20、40 ng/ml，干預(yù)時(shí)間為24 h，使用CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測法和Annexin V/PI雙染法以確定最佳造模濃度。

1.2.3 細(xì)胞給藥 細(xì)胞按照所需組數(shù)接種于96孔板或者6孔板，蟲草多糖設(shè)置濃度為50、100、200 μg/ml共3組，在造模前預(yù)作用時(shí)間為12 h。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 不經(jīng)任何藥物和TNFα處理的正常培養(yǎng)細(xì)胞為正常組(N)，通過實(shí)驗(yàn)篩選確定TNFα造模濃度并作用24 h的細(xì)胞為模型組(M)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，50、100、200 μg/ml蟲草多糖預(yù)作用12 h并給予TNFα造模濃度作用24 h為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.5 檢測內(nèi)容和方法

1.2.5.1 細(xì)胞增殖：CCK8法 細(xì)胞按照5×103/孔接種于96孔板，每組10孔，待細(xì)胞生長至80%以上時(shí)，棄上清，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組并待藥物干預(yù)以及造模后，使用PBS緩沖液0.1 ml/孔清洗1次，加入CCK8工作液(CCK8試劑∶細(xì)胞全培養(yǎng)基=1∶10)0.1 ml/孔，然后于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，選取最佳時(shí)間放入多功能酶標(biāo)儀內(nèi)(450 nm和630 nm波長)讀取各孔吸光度值。

1.2.5.2 肝細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測：Annexin V/PI雙染法 細(xì)胞按照2×106/孔接種于6孔板，每組3孔，待細(xì)胞生長至80%以上時(shí)棄上清，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組并待藥物干預(yù)以及造模后，使用PBS洗滌收集不同組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液搖勻后用195 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞；使細(xì)胞密度為2×105細(xì)胞/ml，分別加入5 μl的Annexin V和FITC染液至195 μl細(xì)胞重懸液，避光，混勻，4 ℃孵育15 min后進(jìn)行上機(jī)檢測，為防止熒光衰變，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.2.5.3 細(xì)胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑(Bax、caspase9)、外源性死亡受體途徑(caspase8、Fas)和關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶caspase3的mRNA表達(dá)：RT-PCR法 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板，每組3孔，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組并待藥物干預(yù)以及造模后，棄上清，使用PBS緩沖液清洗，加入Trizol裂解細(xì)胞，按照說明書使用總RNA抽提試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.5.4 細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase3、cleaved-caspase8蛋白表達(dá):Western Blot法 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，每組3孔，待藥物干預(yù)以及造模后，4 ℃預(yù)冷離心取細(xì)胞沉淀，加入60 μl RIPA細(xì)胞裂解液后置于冰上進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取并使用100 ℃加熱器致蛋白變性3次，每次10 min后取相應(yīng)樣本進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Li-COR)進(jìn)行蛋白印跡顯影并分析。

2 結(jié)果

2.1 TNFα誘導(dǎo)L02正常肝細(xì)胞凋亡模型的建立

2.1.1 不同濃度TNFα對(duì)L02肝細(xì)胞增殖的影響 以不同濃度(0、5、10、20、40 ng/ml)TNFα作用于L02細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖逐漸受到抑制，其中40 ng/ml濃度TNFα對(duì)L02細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用(P<0.01)(圖1)。

2.1.2 不同濃度TNFα對(duì)L02肝細(xì)胞凋亡數(shù)的影響 根據(jù)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用0、20、40 ng/ml的TNFα濃度，通過Annexin V/PI雙染法檢測其誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡數(shù)量隨TNFα濃度升高而增加，其中40 ng/ml組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9.85%±0.87% vs 7.71%±1.20%，P<0.05)(圖2)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以40 ng/ml的TNFα濃度作為誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡的造模濃度。

注：與正常組比較，△△P<0.01。圖1 不同濃度TNFα對(duì)L02肝細(xì)胞增殖的影響

圖2 不同濃度TNFα對(duì)L02肝細(xì)胞凋亡數(shù)的影響

2.2 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 不同濃度蟲草多糖的肝細(xì)胞毒性試驗(yàn) CCK8法檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，50、100、200 μg/ml的蟲草多糖均對(duì)L02肝細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，其中100 、200 μg/ml蟲草多糖顯著促進(jìn)L02肝細(xì)胞增殖(P值均<0.05)(圖3)。

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖3 不同濃度蟲草多糖的肝細(xì)胞毒性試驗(yàn)

2.2.2 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞增殖活力顯著下降(P<0.05)，而50、100、200 μg/ml的蟲草多糖組增殖活力均顯著高于正常組和模型組(P值均<0.01)(圖4)。

2.3 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡數(shù)的影響 Annexin V/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，50、100、200 μg/ml蟲草多糖組凋亡細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(P值均<0.05)；100 μg/ml組作用效果最優(yōu)，其與200 μg/ml組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組M比較，**P<0.01。圖4 不同濃度的蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞增殖的影響

2.4 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡的mRNA表達(dá)影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組的內(nèi)源性線粒體途徑(Bax)、外源性死亡受體途徑Fas的mRNA表達(dá)均顯著升高(P值均<0.05)；50、100、200 μg/ml的蟲草多糖均可顯著降低模型組內(nèi)源性線粒體途徑caspase9的mRNA表達(dá)和關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶caspase3的mRNA表達(dá)(P值均<0.05)；50、100 μg/ml的蟲草多糖可顯著降低Bax mRNA表達(dá)(P值均<0.05)；100、200 μg/ml的蟲草多糖可明顯降低Fas、caspase8 mRNA表達(dá)(P值均<0.05)(表3)

2.5 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與正常組比較，模型組cleaved-caspase3(P<0.05)、cleaved-caspase8(P<0.01)均顯著升高，200 μg/ml蟲草多糖組與模型組比較，cleaved-caspase3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，50、100、200 μg/ml蟲草多糖組的cleaved-caspase8蛋白表達(dá)均明顯降低(P值均<0.01)(圖6)。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與100 μg/ml組比較，&&P<0.01。圖5 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡數(shù)的影響

表3 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡的Bax、caspase 9、 caspase 8、Fas、caspase 3的mRNA表達(dá)影響

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖6 不同濃度蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 討論

外源性死亡受體通路和內(nèi)源性線粒體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，外源性死亡受體途徑主要由TNF超家族成員介導(dǎo)，涉及半胱氨酸蛋白酶的層聯(lián)級(jí)激活，包括caspase8、caspase7、caspase10、caspase3。caspase3的激活導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生，包括核DNA片段化，磷脂酰絲氨酸外露至細(xì)胞膜表面等。內(nèi)源性線粒體途徑中線粒體促凋亡蛋白Bax通過拮抗抗凋亡蛋白Bcl2導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，從而介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放并激活caspase9和凋亡小體的形成，然后caspase9直接激活半胱氨酸蛋白酶3，后續(xù)步驟同外源性死亡受體途徑[9]。越來越多的研究[10]表明細(xì)胞凋亡的失調(diào)廣泛參與了各種疾病和病理過程，包括藥物毒性損傷、免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的損傷、感染以及腫瘤的發(fā)生、代謝紊亂、各種肝臟疾病等。

蟲草多糖是一種重要的機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑，基于肝細(xì)胞凋亡與肝纖維化的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究蟲草多糖對(duì)TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡模型的具體影響以及作用機(jī)制。CCK8細(xì)胞增殖毒性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示：(1)不同濃度的蟲草多糖對(duì)L02正常肝細(xì)胞均無明顯細(xì)胞增殖毒性，其中100、200 μg/ml蟲草多糖對(duì)L02正常肝細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，且可以明顯恢復(fù)TNFα抑制的L02正常肝細(xì)胞的細(xì)胞增殖毒性；(2)100、200 μg/ml蟲草多糖能夠顯著減少TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)量。此外，TNFα誘導(dǎo)L02正常肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的外源性途徑中死亡受體Fas的mRNA以及激活形式cleaved-caspase8的蛋白表達(dá)均升高，F(xiàn)as被激活后可激活caspase8和細(xì)胞凋亡執(zhí)行關(guān)鍵酶caspase3從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；同時(shí)，對(duì)于內(nèi)源性線粒體途徑，Bax作為重要的線粒體促凋亡蛋白，可導(dǎo)致線粒體功能障礙；關(guān)鍵酶caspase9功能與caspase8相近，同樣可激活caspase3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TNFα誘導(dǎo)L02正常肝細(xì)胞Bax、caspase9、caspase3的mRNA和激活形式cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)均升高，而100、200 μg/ml蟲草多糖可顯著抑制外源性途徑和內(nèi)源性途徑中的Fas、caspase8、caspase9的mRNA以及激活形式cleaved-caspase8的蛋白表達(dá)，200 μg/ml蟲草多糖還可以顯著抑制激活形式cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)，蟲草多糖對(duì)肝細(xì)胞凋亡的抑制作用可能隨藥物濃度升高而逐漸增強(qiáng)，因此，在安全藥物濃度的前提下，100、200 μg/ml可能是蟲草多糖抑制TNFα誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的最優(yōu)濃度，未來仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，蟲草多糖抑制肝細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制可能涉及如下：(1)抑制內(nèi)源性線粒體途徑中的促凋亡相關(guān)蛋白功能，保護(hù)線粒體功能完整性；(2)抑制肝細(xì)胞凋亡相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶激活；(3)抑制外源性死亡受體的表達(dá)?？傊撗芯拷Y(jié)果為蟲草多糖及其復(fù)方制劑在抗肝纖維化中的臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明:趙佳男負(fù)責(zé)撰寫論文；彭景華、劉平負(fù)責(zé)審校；胡義揚(yáng)負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。