徐艷艷，趙真真，劉守勝，宋 歡，辛永寧

1 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 a.感染性疾病科，b.臨床研究中心，山東 青島 266011；2 大連醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，遼寧 大連 116000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷[1]，通常被認(rèn)為是代謝綜合征(metabolic syndrome, MetS)的肝臟表現(xiàn)。最近，國際專家組建議將NAFLD改名為代謝性脂肪性肝病(metabolic fatty liver disease, MAFLD)[2]。冠心病(coronary artery disease, CAD)是指在向心臟供應(yīng)氧氣和營養(yǎng)的血管中形成動脈粥樣硬化斑塊所導(dǎo)致的疾病[3]，有著高發(fā)病率及高病死率[4]。MetS包括肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常，這些也是獨(dú)立的CAD危險因素的組合[5]。越來越多的臨床和流行病學(xué)證據(jù)[6-7]表明，NAFLD與罹患心血管疾病和2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)的風(fēng)險增加有關(guān)。NAFLD及CAD發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。NAFLD具有復(fù)雜的疾病特征，環(huán)境與易感多基因宿主背景之間的相互作用決定了疾病表型并影響疾病進(jìn)展。研究[3,8-10]表明，多種基因與NAFLD或CAD的發(fā)病風(fēng)險具有相關(guān)性。

內(nèi)向整流鉀通道蛋白J 亞單位11號成員(potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 11, KCNJ11)編碼內(nèi)向整流鉀通道蛋白Kir6.2。Kir6.2與磺脲類受體共同組成ATP敏感性鉀通道，在糖代謝和細(xì)胞膜的電生理調(diào)節(jié)下，影響胰島素的分泌[11]。KCNJ11在胰腺組織中高表達(dá)，并與T2DM的易感性密切相關(guān)[12-13]。國內(nèi)外多項研究證實(shí)，KCNJ11基因不同突變位點(diǎn)可導(dǎo)致一系列連續(xù)的、不同輕重的糖代謝異常，包括新生兒糖尿病[14]、青少年發(fā)病的成人型糖尿病[15]、T2DM、嬰兒持續(xù)性高胰島素血癥性低血糖癥[16]。KCNJ11編碼的Kir6.2離子通道的遺傳多態(tài)性對微血管功能障礙和缺血性心臟病的易感性具有重要的影響[17]。目前，國內(nèi)外關(guān)于KCNJ11 rs5210的研究較少，其中，大部分為與T2DM的相關(guān)性研究[12]，尚無同時納入NAFLD和CAD患者KCNJ11 rs5210的相關(guān)研究。鑒于NAFLD、CAD及T2DM同為代謝性疾病，有多種共同的危險因素[18-20]，亦可能具有共同的易感性多態(tài)性位點(diǎn)。本研究旨在探討KCNJ11 rs5210位點(diǎn)多態(tài)性與青島地區(qū)漢族人群NAFLD、NAFLD合并CAD的遺傳易感相關(guān)性，并為NAFLD及CAD的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 NAFLD組為2018年12月—2019年9月青島市市立醫(yī)院收治的NAFLD患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年版《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[21]；健康對照組為同期體檢中心健康體檢者，均通過生化指標(biāo)結(jié)合超聲檢查確認(rèn)；CAD組為同期經(jīng)皮冠脈造影，3支大血管至少1支狹窄超過50%且排除NAFLD的患者；合并組為同期確診為NAFLD合并CAD的患者。所有患者的選擇均采取隨機(jī)法。

1.2 標(biāo)本采集 各研究對象均在禁食12 h后，于次日早晨，測量身高、體質(zhì)量，計算BMI=體重(kg)/身高2(m2)。同時采集受試者的年齡、性別等基本臨床信息。抽取正中靜脈血5 ml，分別置于2個EDTA抗凝管中，其中一管送本院檢驗(yàn)科，進(jìn)行生化學(xué)指標(biāo)檢測，包括空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、ALT、AST、GGT、ALP、TBil;另一管血液離心后，將血清與全血細(xì)胞分離，置于-80 ℃冰箱保存，以備DNA提取。

1.3 基因組DNA提取、基因型鑒定 全血基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒(博淼生物科技有限公司，北京)。采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)方法進(jìn)行KCNJ11目的基因的擴(kuò)增，并進(jìn)行多態(tài)基因型分析。PCR引物由同一公司設(shè)計合成，引物序列為：上游5′-ACGTTGGATGAGTACCTCCCACAGCCTCT-3′，下游5′-ACGTTGGATGATTTTTGTCCCTGCTCCTCC-3′。PCR擴(kuò)增：首先95 ℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?4 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min。所得 PCR產(chǎn)物在110 V電壓下進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min。并得到相應(yīng)大小的條帶。KCNJ11 rs5210位點(diǎn)的基因型通過基因測序方法進(jìn)行鑒定。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)由青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批號：2017臨審字第20號(快)，受試者知情同意。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入905例，其中NAFLD組246例,CAD組201例，合并組116例, 對照組342例。4組患者一般臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較的結(jié)果見表1，各指標(biāo)在不同組間具有不同程度的差異。

NAFLD組、CAD組、合并組、對照組rs5210位點(diǎn)基因型分布均符合基因遺傳平衡法則，來自同一群體(NAFLD組:χ2=1.493,P>0.05; CAD組:χ2=0.112,P>0.05; 合并組:χ2=0.877,P>0.05; 對照組:χ2=0.047,P>0.05)。

2.2 KCNJ11 rs5210 基因型及等位基因的頻率分布 經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)KCNJ11 rs5210具有AA、GA、GG 3種基因型，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,對照組、NAFLD組、CAD組及合并組之間rs5210 位點(diǎn)等位基因頻率和基因型分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)(表2)。經(jīng)校正年齡、性別、BMI后，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.3 攜帶不同基因型患者各生化指標(biāo)比較 分析KCNJ11 rs5210位點(diǎn)多態(tài)性不同基因型對全部受試人群及各組患者臨床特征的影響，結(jié)果顯示，全部受試人群中，攜帶AA基因型受試者ALP水平高于GA基因型(P=0.048)；在NAFLD組中，與攜帶AA基因型受試者相比，GA基因型攜帶者具有更高的BMI、TBil水平(P值分別為0.042、0.002)(表3、4)。在CAD組、合并組及對照組中，KCNJ11 rs5210 G等位基因的攜帶者與非攜帶者之間，未觀察到臨床參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)。

表1 4組之間一般臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表2 KCNJ11 rs5210 位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布

2.4 患病風(fēng)險因素分析結(jié)果 經(jīng)非條件logistic 回歸分析表明，BMI升高與NAFLD患病風(fēng)險相關(guān)；HDL降低提示NAFLD患病風(fēng)險增加；FPG升高、HDL降低提示CAD、NAFLD+CAD患病風(fēng)險增加(P值均<0.05)(表5)。

3 討論

本研究首次在905例樣本中探討KCNJ11基因rs5210位點(diǎn)多態(tài)性與青島地區(qū)漢族人群NAFLD或NAFLD合并CAD發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。

表3 全部受試人群 KCNJ11 rs5210 位點(diǎn)多態(tài)性不同基因型之間各指標(biāo)比較

表4 NAFLD組 KCNJ11 rs5210 位點(diǎn)多態(tài)性不同基因型之間各指標(biāo)比較

表5 NAFLD、CAD及NAFLD+CAD危險因素的logistic回歸分析結(jié)果

多項研究[22-24]證實(shí)，KCNJ11基因多態(tài)性(包括 rs5210)與T2DM易感性有關(guān)。KCNJ11多態(tài)性的研究[25-27]表明，KCNJ11與心血管疾病有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)性高血壓中，敲除KCNJ11基因的小鼠容易發(fā)生充血性心力衰竭和死亡[28]。然而目前，國內(nèi)外尚無研究證實(shí)KCNJ11 rs5210多態(tài)性與NAFLD、CAD的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。本研究亦未發(fā)現(xiàn)KCNJ11 rs5210位點(diǎn)多態(tài)性與NAFLD或CAD易感性的相關(guān)性(P>0.05)。鑒于KCNJ11基因功能，即該基因多態(tài)性可能通過降低ATP敏感性鉀通道對于ATP的敏感性，抑制胰島素釋放[22]，從而影響糖代謝，該過程與肝臟脂肪蓄積無明顯相關(guān)性。而降低了ATP敏感性鉀通道對ATP的敏感性，亦有可能誘發(fā)心血管疾病，如心臟舒張功能障礙、高血壓及心力衰竭等[29]。CAD的潛在發(fā)病機(jī)制涉及脂質(zhì)代謝失衡和適應(yīng)不良的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致動脈壁的慢性炎癥[30]。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)KCNJ11 rs5210與CAD及CAD合并NAFLD發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，但由于KCNJ11 rs5210多態(tài)性對于T2DM的影響是確定的，而NAFLD、CAD常與T2DM、肥胖等同時存在，因此，在不同人群中仍不能忽視該基因位點(diǎn)在NAFLD及CAD中的作用。

眾所周知，肥胖是NAFLD的危險因素。有研究[31]結(jié)果顯示，在中國漢族人群中，NAFLD及NAFLD合并CAD患者的BMI水平較高。本研究經(jīng)非條件logistic 回歸分析結(jié)果顯示，BMI升高與NAFLD患病風(fēng)險相關(guān)，與之前的研究結(jié)果一致。Zhuang等[32]研究表明，中國漢族人群T2DM患者中，KCNJ11多態(tài)性與BMI水平有相關(guān)性。然而澳大利亞等多個地區(qū)在T2DM患者與健康人群中的研究[22,33-35]表明，KCNJ11多態(tài)性與BMI無明顯相關(guān)性。KCNJ11多態(tài)性與BMI的相關(guān)性在不同研究中結(jié)論不完全一致。而在本研究中，在NAFLD組，與攜帶 rs5210 AA基因型受試者相比，GA基因型攜帶者BMI水平更高(P<0.05)，差異原因可能是研究人群地域分布不同或者人群本身合并基礎(chǔ)疾病不同。

NAFLD患者血脂異常的特征為TG升高，HDL降低，這種血脂異?？赡芘cNAFLD患者CAD患病風(fēng)險增加有關(guān)，因?yàn)橹|(zhì)異常與CAD發(fā)病率和/或死亡率獨(dú)立相關(guān)[36-37]。本研究非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示，HDL降低提示NAFLD患病風(fēng)險增加；FPG升高、HDL降低提示CAD、NAFLD+CAD患病風(fēng)險增加，與其他研究結(jié)論相一致。目前，尚無研究明確證實(shí)KCNJ11基因多態(tài)性與血脂水平具有相關(guān)性。如印度的一項研究[38]顯示，KCNJ11 rs5210 G等位基因攜帶與T2DM患者的BMI、FPG、HDL、LDL等生化指標(biāo)無明顯相關(guān)性。本研究亦未發(fā)現(xiàn)G等位基因攜帶對TG、TC等其他血脂水平的影響。鑒于NAFLD和CAD的發(fā)生均與脂質(zhì)代謝異常有關(guān)，該結(jié)果與前文所述KCNJ11 rs5210多態(tài)性與NAFLD和CAD多態(tài)性無明顯相關(guān)性的結(jié)論相一致。

綜上所述，本研究首次探討了KCNJ11 rs5210多態(tài)性與青島地區(qū)漢族人群NAFLD及CAD發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，結(jié)果表明，KCNJ11 rs5210位點(diǎn)基因型和等位基因與NAFLD及CAD發(fā)病風(fēng)險無明顯相關(guān)性，且未發(fā)現(xiàn)G等位基因攜帶者對于TG、TC等其他血脂水平的影響。然而，NAFLD患者KCNJ11 rs5210 GA基因型攜帶者比AA基因型攜帶者具有更高的BMI，該基因位點(diǎn)對NAFLD及CAD發(fā)病風(fēng)險的影響仍不能忽視。此外，本研究存在一些局限性，將來可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量并擴(kuò)大地域范圍，而且KCNJ11 rs5210多態(tài)性與BMI之間相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐艷艷負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；趙真真、劉守勝、宋歡參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；辛永寧負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。