付喜花，黃 璇，沈國俊，婁海波，毛玉巧

1 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院 感染科，廣州 511400； 2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 感染科，廣州 510515；3 九江市第三人民醫(yī)院 肝病防治?？疲?九江 332000

慢性乙型肝炎(CHB)是肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的主要原因[1]。核苷類藥物可以有效抑制HBV復(fù)制，但需要長期治療，且停用后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，因此尋找預(yù)測抗病毒療效的指標(biāo)成為CHB治療的重要臨床問題[2-3]。HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換作為HBeAg陽性的CHB患者抗病毒療效反應(yīng)的重要替代終點(diǎn)之一，在臨床研究中得到廣泛認(rèn)可[4-5]。

近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)血清抗-HBc定量對于預(yù)測CHB患者抗病毒療效具有重要意義，發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者其治療前血清抗-HBc定量明顯升高[6-7]。另外，核苷類藥物抗病毒停藥時(shí)高血清抗-HBc定量與停藥后復(fù)發(fā)率降低有關(guān)[8]。抗-HBc的產(chǎn)生由HBV中的HBcAg刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生，而HBcAg在肝內(nèi)分布特點(diǎn)以及其對免疫細(xì)胞的刺激作用的相關(guān)研究報(bào)道仍然相對缺乏。因此，深入探索HBcAg表達(dá)與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系，將有助于CHB患者臨床療效的預(yù)測，對CHB治療新靶點(diǎn)研發(fā)具有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年1月—2018年6月在南方醫(yī)院和番禺區(qū)中心醫(yī)院采用核苷類藥物行抗病毒治療的101例CHB患者作為研究對象，并對所有患者隨訪96周?；颊咴\斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[1]，且為HBeAg陽性，并排除了合并甲、丙、丁和戊型肝炎，自身免疫性肝病。排除未經(jīng)抗病毒治療或者使用了干擾素治療方案的患者。

1.2 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)所用的血清為臨床檢測項(xiàng)目剩余標(biāo)本。采用美國Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測患者血清中的生化指標(biāo)(ALT、AST、TBil)；采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(試劑購自廣州達(dá)安基因診斷中心)；采用Abbott i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物中的各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.3 肝臟病理和HBcAg免疫組化染色 所有患者均接受B超引導(dǎo)下的肝穿刺活檢，采用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片制作由病理科醫(yī)生負(fù)責(zé)。5 μm石蠟切片在65 ℃中脫蠟2 h后水化，PBS緩沖液充分洗滌后在枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，3% H2O2浸泡10 min，PBS緩沖液洗滌，10% BSA常溫封閉1 h，加入兔抗人HBcAg抗原抗體[基因科技(上海)股份有限公司，貨號GB058607]，4 ℃孵育16 h，PBS洗滌后加入羊抗兔HRP，DAB進(jìn)行顯色。HBcAg免疫組化結(jié)果通過Image J軟件進(jìn)行半定量分析，HBcAg表達(dá)量在0～5%為 Ⅰ 級，5%～25%為 Ⅱ 級，25%～50%為 Ⅲ 級，大于50%為 Ⅳ 級。

1.4 GEO數(shù)據(jù)庫分析 通過GEO2R網(wǎng)上在線分析工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析GSE96851數(shù)據(jù)集中的差異基因表達(dá)。該數(shù)據(jù)庫中10例肝移植供者肝臟組織和7例血管瘤患者切除肝組織為對照組，急性肝衰竭患者組織4例為實(shí)驗(yàn)組(其中3例標(biāo)本有4個(gè)重復(fù)檢測數(shù)據(jù)，1例標(biāo)本有5個(gè)重復(fù)檢測數(shù)據(jù)，共17個(gè)測序數(shù)據(jù))。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC (fold change)|≥2且調(diào)整后的P值<0.05?；鹕綀D使用EXCEL作圖。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 干燥采血管收集患者2 ml全血，離心后留取血清標(biāo)本。采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司的總核心抗體定量和IgM型核心抗體ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行操作，對患者血清中的核心抗體進(jìn)行檢測。使用美國博騰公司酶標(biāo)儀Gen5，讀取450 nm檢測值，使用分光光度(optical density,OD)值進(jìn)行比較分析。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會審批，批號：PYRC-2020-020，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者基本信息 101例患者在接受96周抗病毒治療后，有17例患者發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和未轉(zhuǎn)換患者在基線時(shí)，年齡、AST、TBil、HBV DNA載量和HBsAg定量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)，但是發(fā)生HBeAg轉(zhuǎn)換的患者ALT水平較高(P=0.035)(表1)。

2.2 CHB患者肝內(nèi)HBcAg的表達(dá)類型和方式 通過對101例患者肝穿活檢石蠟標(biāo)本進(jìn)行HBcAg免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHB患者肝內(nèi)HBcAg表達(dá)主要分成4個(gè)類型，分別為無表達(dá)型、核型表達(dá)(HBcAg表達(dá)于肝細(xì)胞核)、漿型表達(dá)(HBcAg表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿)和核漿表達(dá)(HBcAg同時(shí)表達(dá)于肝細(xì)胞核和胞漿)(圖1)。

2.3 HBcAg表達(dá)類型、病理分級與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的關(guān)系 按照HBcAg在肝內(nèi)不同的表達(dá)類型分組，96周核苷類抗病毒治療后，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率在不同組間存在顯著差異(χ2=4.753，P=0.037)。按照不同HBcAg分級分組，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率同樣在不同組間存在顯著差異(χ2=6.580，P=0.016)(表2)。

2.4 抗-HBc定量在HBcAg不同類型患者的差異 ELISA結(jié)果顯示，血清IgM型抗-HBc、總抗-HBc在無表達(dá)型、核型、漿型和核漿型患者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.760，P=0.021；H=21.46，P<0.001)；血清IgM型抗-HBc、總抗-HBc在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級患者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=18.80，P<0.001；H=26.03，P<0.001)。組間進(jìn)一步比較，無表達(dá)組血清IgM 抗-HBc表達(dá)明顯低于漿型表達(dá)組(P=0.003)(圖2a)；而在總抗-HBc表達(dá)上，無表達(dá)組低于漿型表達(dá)組(P=0.001)和核漿表達(dá)組(P<0.001)，核型表達(dá)組低于漿型表達(dá)組(P=0.036)和核漿表達(dá)組(P=0.005)(圖2b)。HBcAg病理Ⅱ、Ⅲ級患者IgM型抗-HBc水平高于Ⅰ級患者，Ⅲ、Ⅳ級的患者，其總抗-HBc水平高于Ⅰ級和Ⅱ級患者(P值均<0.05)(圖2c、d)。

表1 CHB患者基本資料

表2 不同HBcAg表達(dá)類型、分級的患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換情況

注：箭頭代表HBcAg陽性表達(dá)。

圖2 肝內(nèi)不同HBcAg表達(dá)類型、分級患者血清抗-HBc的水平

2.5 HBcAg陽性的肝炎活動(dòng)患者肝內(nèi)差異基因表達(dá) 通過GSE96851基因表達(dá)芯片分析，發(fā)現(xiàn)HBcAg陽性的急性肝衰竭患者相對于對照組患者，肝內(nèi)B細(xì)胞基因MS4A1(即CD20分子)和抗體相關(guān)基因(IGHA2、IGHD、IGHM、IGHV3、IGHV4-31、IGK、IGKC、IGKV1OR2-108、IGKV1OR2-118、IGLC1、IGLJ3、IGLL3P、IGLL5、IGLV1-44、IGSF6)有明顯上調(diào)表達(dá)。結(jié)果提示肝炎活動(dòng)患者，肝內(nèi)B細(xì)胞活化及抗體產(chǎn)生等免疫反應(yīng)明顯激活(圖3)。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)我國目前約有CHB患者3000萬，且每年約有30萬人死于乙型肝炎相關(guān)肝硬化、肝癌及終末期肝病，帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前核苷類藥物治療僅能有效抑制HBV的復(fù)制，而難以達(dá)到臨床治愈，探索并挖掘預(yù)測臨床療效的指標(biāo)和分子機(jī)制，具有重要的臨床意義。在本研究中，對101例HBeAg陽性的CHB患者進(jìn)行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)抗病毒基線時(shí)CHB患者肝內(nèi)HBcAg表達(dá)具有不同的表達(dá)類型及表達(dá)強(qiáng)度，漿型和核漿表達(dá)患者在核苷類抗病毒治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率較高，HBcAg表達(dá)強(qiáng)度為Ⅲ級患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率也較高。

已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[9-10]表明，B淋巴細(xì)胞在HBV感染的控制中發(fā)揮重要作用，而CHB患者體內(nèi)HBV特異性B淋巴細(xì)胞功能明顯受到抑制或者損害，以至不能產(chǎn)生特異性抗體[11]。HBcAg具有強(qiáng)免疫原性，有利于機(jī)體免疫細(xì)胞的活化[12]，然而其主要在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而極少分泌到外周血中，從而影響其對免疫的調(diào)節(jié)作用，與以往報(bào)道類似[13-15]。其中，漿型和核漿型表達(dá)患者，以及肝內(nèi)HBcAg表達(dá)越高的患者，其血清中總抗-HBc和IgM型抗-HBc明顯升高，提示肝臟炎癥損傷時(shí)，HBcAg暴露或者釋放到血液循環(huán)中，激活了免疫細(xì)胞。因此，HBcAg在肝細(xì)胞的表達(dá)類型與表達(dá)水平，可能是影響患者免疫功能和抗病毒療效的因素之一。

近年來，不斷有文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道血清抗-HBc定量檢測可以作為CHB患者接受核苷類或者干擾素治療后預(yù)測HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，然而其中的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。既往臨床實(shí)踐表明，HBcAg在血清中難以被檢測，主要原因在于其被HBsAg包裹而無法暴露，更難以直接刺激免疫細(xì)胞。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)HBcAg由細(xì)胞核向細(xì)胞胞漿表達(dá)的轉(zhuǎn)變中，與血清總抗-HBc和IgM型抗-HBc定量有明顯關(guān)系，推測HBV感染患者在肝炎波動(dòng)時(shí)，肝細(xì)胞損傷后HBcAg由胞核向胞漿甚至是胞膜外暴露，激活機(jī)體免疫反應(yīng)(尤其是B細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生HBV特異性抗體)，這在一定程度上解釋了抗-HBc定量預(yù)測CHB患者抗病毒治療后發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的免疫學(xué)機(jī)制。

圖3 HBcAg陽性急性肝衰竭組織(4例)與對照肝組織(10例肝移植供者肝臟組織和7例血管瘤切除肝組織)肝內(nèi)差異基因表達(dá)(數(shù)據(jù)來源于GSE96851)

綜上所述，HBcAg在肝細(xì)胞中的檢測對CHB患者核苷類藥物抗病毒療效預(yù)測具有重要作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：付喜花負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；黃璇、婁海波、毛玉巧參與收集數(shù)據(jù)，資料分析；沈國俊負(fù)責(zé)指導(dǎo)修改文章并最后定稿。