杜萬(wàn)威，耿 建，楊逸帆，王 霞，傅涓涓，潘修成

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染性疾病科，江蘇 徐州 221002

在我國(guó)，HBV感染是慢性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要病因[1-2]，其中機(jī)體抗HBV天然免疫和特異性免疫反應(yīng)不足是HBV感染慢性化的關(guān)鍵原因[3]。漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是人體產(chǎn)生內(nèi)源性Ⅰ型IFN的主要天然免疫細(xì)胞[4]，不僅直接發(fā)揮抗病毒作用，還能激活自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞，從而誘導(dǎo)并增強(qiáng)抗病毒免疫應(yīng)答[5]。既往研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，HBV顆?；騂BsAg抑制pDC通過(guò)Toll樣受體9(TLR9)通路表達(dá)IFNα，可能是HBV感染慢性化的重要原因。近期研究[9]發(fā)現(xiàn)，pDC中還存在不依賴(lài)TLR9的Ⅰ型IFN信號(hào)通路，即環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)-IFN基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)-Ⅰ型IFN信號(hào)通路。STING是調(diào)控Ⅰ型IFN基因表達(dá)的重要接頭蛋白。細(xì)胞內(nèi)游離的雙鏈DNA在cGAS作用下，催化合成的環(huán)鳥(niǎo)甘酸-腺苷酸(cyclin GMP-AMP，cGAMP)直接激動(dòng)STING 蛋白，然后通過(guò)TBK1介導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)核轉(zhuǎn)移進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型IFN表達(dá)[10]。作為產(chǎn)生內(nèi)源性Ⅰ型IFN的主要細(xì)胞，pDC可以攝取HBV顆粒、HBsAg等，并與其相互作用進(jìn)一步影響pDC功能[4]。目前關(guān)于HBV感染和STING誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答通路之間關(guān)系的研究較少，HBsAg對(duì)pDC的STING-Ⅰ型IFN通路是否有抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究初步觀察HBsAg對(duì)pDC通過(guò)激活STING通路表達(dá)Ⅰ型IFN功能的影響，以期進(jìn)一步揭示HBV持續(xù)感染的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)為慢性HBV感染免疫治療方案的制訂提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年2月—12月于徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科門(mén)診及住院的慢性HBV感染者及體檢的健康成人外周靜脈全血。慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除外HCV、HDV或HIV重疊感染；(2)妊娠或哺乳期婦女；(3)合并酒精性肝炎、免疫性疾??；(4)伴其他嚴(yán)重疾病如惡性腫瘤，嚴(yán)重心、肺、腎、精神疾病，甲狀腺功能亢進(jìn)，糖尿病等。

1.2 材料 淋巴細(xì)胞分離液(Excellbio，中國(guó))，IFNα ELISA試劑盒(Excellbio，中國(guó))，IFNβ ELISA試劑盒(Excellbio，中國(guó))，TNFα ELISA試劑盒(Excellbio，中國(guó))，2′3′-cGAMP(Invitrogen, 法國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體(eBioscience，美國(guó))，BDCA4樹(shù)突狀細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, 德國(guó))，磁珠分選套裝(Miltenyi Biotec, 德國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) 分別采集慢性HBV感染者和健康成人外周靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液以聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離PBMC，培養(yǎng)基懸浮供后續(xù)實(shí)驗(yàn)取用。

1.3.2 PBMC培養(yǎng) 慢性HBV感染者與健康成人PBMC(2×106/ml)分別加入cGAMP(終濃度200 nmol/L)刺激16 h后留取上清-80 ℃保存。健康成人PBMC(2×106/ml)加入HBsAg(50 μg/ml)孵育24 h，然后加cGAMP(終濃度200 nmol/L)刺激16 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，留取培養(yǎng)上清-80 ℃保存。

1.3.3 磁珠分選 按前述方法獲取健康成人PBMC(2×106/ml)以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(100 μl)懸浮，分別加FCR-Blocking(100 μl)、抗-BDCA4(10 μl)后混勻、孵育、洗滌并離心后去上清，用PBS重懸后，按套裝操作說(shuō)明上機(jī)分選pDC。取分選后的PBMC即pDC - PBMC(1×106)體外以cGAMP按前述方法處理后收集上清供ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子，同時(shí)設(shè)置未去除PBMC作為對(duì)照組。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)pDC 健康成人PBMC分別按前述方法予以HBsAg和cGAMP處理后，用100 μl的PBS懸浮并加入FITC標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56各5 μl，再加入PE標(biāo)記的CDl23和APC標(biāo)記的CD303各10 μl，然后加FCR-Blocking 20 μl，室溫避光孵育30 min。加入固定劑A 100 μl，固定15 min后離心(1500 r/min，5 min)棄上清，100 μl PBS懸浮并加固定劑A 100 μl，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)pDC細(xì)胞頻數(shù)，APC-CD123和PE-BDCA2雙陽(yáng)性的細(xì)胞即為pDC。

1.3.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)研究對(duì)象血清IFNα、IFNβ和TNFα水平。檢測(cè)細(xì)胞上清IFNα水平。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：XYFY2020KL05201，入組患者均采取自愿原則，并簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入慢性HBV感染者43例，男27例，女16例，平均(32.43±8.60)歲；健康成人10例，男6例，女4例，平均(25.52±11.15)歲。2組研究對(duì)象在年齡、性別方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.2 慢性HBV感染者PBMC生成IFNα水平降低 與健康對(duì)照組相比，慢性HBV感染者的PBMC分泌IFNα水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.868，P=0.001)。而2組間TNFα水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值>0.05)(表1)。此外，以cGAMP激活STING通路，在慢性HBV感染者或健康對(duì)照組PBMC培養(yǎng)上清中均未檢測(cè)到IFNβ分泌。

表1 cGAMP刺激慢性HBV感染者和健康人群 PBMC細(xì)胞因子表達(dá)

2.3 HBsAg抑制cGAMP誘導(dǎo)健康成人PBMC分泌IFNα的能力 將HBsAg與健康人PBMC預(yù)先共孵育，然后以cGAMP刺激，采用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IFNα水平。結(jié)果顯示，cGAMP刺激可誘導(dǎo)健康人PBMC高水平分泌IFNα，而預(yù)先與HBsAg共培養(yǎng)過(guò)的PBMC分泌IFNα水平(448.5±52.0)相比，未培養(yǎng)組(571.0±30.8)明顯降低(t=4.500，P=0.011)。

2.4 cGAMP誘導(dǎo)健康人PBMC中pDC生成IFNα 采用磁珠分選法去除健康人PBMC中的pDC，以cGAMP刺激16 h，ELISA法檢測(cè)上清液中IFNα水平，并與未去除pDC的健康人PBMC比較，結(jié)果顯示去除pDC組PBMC(pDC- PBMC組)培養(yǎng)上清IFNα水平(164.50±40.73)較未去除組(339.50±35.334)顯著降低(t=6.482，P=0.001)。

2.5 HBsAg抑制cGAMP-STING通路激活后健康人PBMC中pDC頻數(shù) 將健康成人PBMC預(yù)先與HBsAg共培養(yǎng)后并予cGAMP刺激，以流式細(xì)胞術(shù)分析pDC頻數(shù)，結(jié)果顯示cGAMP組外周血pDC細(xì)胞頻數(shù)明顯高于HBsAg+cGAMP組(P<0.05)(表2)。

表2 HBsAg對(duì)cGAMP刺激后的PBMC中pDC頻數(shù)的影響

3 討論

HBsAg是HBV的外膜蛋白，在HBV感染期間大量產(chǎn)生，并游離存在于慢性HBV感染者外周血循環(huán)。長(zhǎng)期高載量HBsAg可導(dǎo)致抗HBV特異性T淋巴細(xì)胞耗竭以及干擾中和抗體結(jié)合[12]。不僅如此，HBsAg對(duì)機(jī)體抗HBV天然免疫反應(yīng)也有抑制作用。近年研究[6]發(fā)現(xiàn)，HBsAg對(duì)pDC中TLR9通路誘導(dǎo)生成IFNα有抑制作用，可能是慢性HBV感染者外周pDC功能低下的重要原因。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染者外周pDC功能低下還與其STING通路誘導(dǎo)IFNα表達(dá)受到HBsAg抑制有關(guān)。

胞質(zhì)中的游離DNA被DNA識(shí)別受體cGAS識(shí)別后，催化合成cGAMP以激活靶定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING蛋白，進(jìn)而活化IRF3入核介導(dǎo)Ⅰ型IFN或活化NF-κB介導(dǎo)TNFα及IL-6等炎癥因子表達(dá)[13-15]。本研究以cGAMP體外刺激PBMC，結(jié)果顯示，慢性HBV感染者PBMC分泌IFNα能力明顯低于正常對(duì)照組，而2組間TNFα分泌無(wú)明顯差異，提示慢性HBV感染者PBMC中STING-IRF3-IFNα分泌通路受到影響，而TNFα表達(dá)量無(wú)明顯改變。

慢性HBV感染者cGAMP誘導(dǎo)PBMC分泌IFNα水平低下可能與HBV顆粒、HBsAg或HBeAg等對(duì)其的抑制作用有關(guān)。已有研究[6]證實(shí)，HBsAg對(duì)pDC中TLR9誘導(dǎo)的IFN反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，筆者推測(cè)HBsAg可能對(duì)cGAMP誘導(dǎo)PBMC的Ⅰ型IFN表達(dá)也有抑制作用。本研究以HBsAg預(yù)先與健康人PBMC共孵育，發(fā)現(xiàn)cGAMP誘導(dǎo)HBsAg預(yù)處理的健康人PBMC分泌IFNα的水平明顯低于未經(jīng)HBsAg預(yù)處理組，證實(shí)了筆者的推測(cè)，即HBsAg對(duì)cGAMP誘導(dǎo)PBMC通過(guò)STING通路表達(dá)IFNα能夠發(fā)揮抑制作用。

pDC是機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性IFNα的主要細(xì)胞，是人體天然免疫應(yīng)答的主要組成部分。有研究[5]報(bào)道，pDC受到HBV刺激后，分泌IFNα的能力是其他血細(xì)胞的100～1000倍。本研究也發(fā)現(xiàn)，將PBMC中pDC采用磁珠分選法去除后，再用cGAMP予以刺激，結(jié)果顯示，去除pDC的PBMC分泌IFNα能力顯著降低，證實(shí)pDC是PBMC中cGAMP激活STING通路產(chǎn)生IFNα的主要細(xì)胞。

為了進(jìn)一步研究HBsAg對(duì)外周血pDC功能影響的機(jī)制，筆者用流式細(xì)胞儀檢測(cè)pDC頻數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cGAMP作用下的PBMC中pDC頻數(shù)增加，而HBsAg預(yù)孵的PBMC在cGAMP作用下pDC頻數(shù)明顯下降。這可能是HBsAg抑制cGAMP誘導(dǎo)PBMC分泌IFNα的重要原因，具體機(jī)制筆者團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)一步研究中。

綜上所述，HBsAg對(duì)cGAMP激活pDC中STING通路表達(dá)IFNα有抑制作用，這對(duì)進(jìn)一步研究HBV持續(xù)感染的免疫發(fā)生機(jī)制及慢性HBV感染的免疫治療方案的制訂具有重要意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：杜萬(wàn)威、耿建、潘修成負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)；杜萬(wàn)威、耿建負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作，資料分析和撰寫(xiě)論文；楊逸帆、王霞、傅涓涓參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；潘修成負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。