顏鳳霞， 王蓮輝， 田 凡， 李 濤

(1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院， 貴陽(yáng) 550005； 2.貴陽(yáng)市林草資源監(jiān)測(cè)中心， 貴陽(yáng) 550003)

長(zhǎng)瓣兜蘭(Paphiopedilumdianthum)為蘭科兜蘭屬植物，分布于貴州、云南和廣西等省區(qū)，因其獨(dú)特的外觀和優(yōu)雅的花型而具有較高的觀賞價(jià)值[1]。長(zhǎng)瓣兜蘭還是中國(guó)少有的多花兜蘭，常受育種工作者的青睞，將其作為親本進(jìn)行育種，但由于遭受人類毀滅性采挖，野生資源極少，已處于瀕危狀態(tài)[2]。

王蓮輝等[1]對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭的研究?jī)H限于其栽培、組織培養(yǎng)及無(wú)菌播種快速繁殖體系等研究，在分子生物學(xué)層面的研究未見(jiàn)報(bào)道。兜蘭屬植物花發(fā)育及開(kāi)花的分子機(jī)制及相關(guān)基因的挖掘也鮮見(jiàn)報(bào)道。RNA-seq 技術(shù)是近年來(lái)興起用于在分子層面研究動(dòng)物、植物、微生物的新技術(shù)[3-6]，該技術(shù)已應(yīng)用于蘭科植物多方面的研究。如在擬蘭屬中，Lin等[7]通過(guò)對(duì)其進(jìn)行基因組測(cè)序，研究了其進(jìn)化關(guān)系。Li等[8]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ι热~文心蘭中MADS-box家族基因進(jìn)行分析。近年來(lái)已有兩個(gè)兜蘭品種通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，開(kāi)發(fā)出了SSR分子標(biāo)記[9]。為了豐富兜蘭分子生物學(xué)研究數(shù)據(jù)，挖掘與兜蘭屬花發(fā)育的相關(guān)基因。本研究利用RNA-seq 技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，以期為解析長(zhǎng)瓣兜蘭花發(fā)育及開(kāi)花的調(diào)控機(jī)制、培育優(yōu)良兜蘭品種奠定基礎(chǔ)，并為其基因組測(cè)序組裝提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以種植于貴州省林業(yè)科學(xué)研究院蘭花資源圃中生長(zhǎng)健壯的長(zhǎng)瓣兜蘭為實(shí)驗(yàn)材料， 7月和8月采集其花蕾和盛開(kāi)花朵，每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。花蕾和花朵采集后用液氮處理后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本研究用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(天根)分別對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭花蕾和花朵的總RNA進(jìn)行提取。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，并用賽默飛公司的Multiscan GO對(duì)總RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

通過(guò)RNA 質(zhì)量檢測(cè)符合標(biāo)準(zhǔn)后，委托上海生工生物工程股份有限公司對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭花器官兩個(gè)不同時(shí)期花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除只含有測(cè)序接頭序列和N 含量過(guò)高以及低質(zhì)堿基(Q值<20)及過(guò)短的序列數(shù)據(jù)。利用Trinity軟件拼接完成后，將所得核苷酸序列分別與NR、KEGG、KOG、Swissprot等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得與長(zhǎng)瓣兜蘭花器官轉(zhuǎn)錄本所對(duì)應(yīng)的注釋信息。使用MISA軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR檢測(cè)。利用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)分析基因表達(dá)情況[10]。采用Ballgown對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭花蕾和花差異表達(dá)基因進(jìn)行分析[10]。差異基因篩選條件設(shè)置為|log 2 foldchange|>1且校正P-value(FDR)<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

通過(guò)Illumina 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序后，分別獲得484 702 56條和448 037 28條clean reads。兩個(gè)樣本的總的堿基數(shù)分別為665 508 257 3和619 826 070 2，GC含量占比分別為52.38%和52.64%， Q 20占比分別為99.11%和99.06%，Q 30占比分別為96.98%和96.85%。在堿基的組成分布情況中 (圖1)，橫軸表示reads的位置，縱軸表示四種堿基分布的百分比。理論上，在測(cè)序過(guò)程中，A、T和G、C的含量在每個(gè)循環(huán)上應(yīng)分別相等，保持穩(wěn)定不變，呈水平線。但是，由于通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增存在偏差的原因，會(huì)引起在測(cè)序得到的每個(gè)read前6～7個(gè)堿基有較大波動(dòng)，但這種波動(dòng)屬正常情況。在堿基質(zhì)量分布情況中 (圖2)，橫軸表示reads堿基所處位置，縱軸表示所有reads在該堿基位置上的質(zhì)控得分 (0～40)。其中紅色表示中位數(shù)，黃色代表25%～75%區(qū)間，觸須代表10%～90%區(qū)間，藍(lán)線處為平均數(shù)。高通量測(cè)序是雙端測(cè)序，每條read的長(zhǎng)度為150 bp。隨著測(cè)序的進(jìn)行會(huì)導(dǎo)致酶的活性逐步降低，因此，當(dāng)測(cè)序達(dá)一定長(zhǎng)度后，堿基的質(zhì)量值會(huì)隨之降低。但是，在本研究中，所有 reads在該堿基上的質(zhì)控得分均處于綠色區(qū)域，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量可接受。

2.2 長(zhǎng)瓣兜蘭花器官轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與拼接組裝

由于長(zhǎng)瓣兜蘭基因組測(cè)序尚未完成，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)只能進(jìn)行無(wú)參考基因組的分析。下機(jī)數(shù)據(jù)獲得后，進(jìn)行組裝測(cè)序數(shù)據(jù)，產(chǎn)生重組群和單一序列，重頭組裝可為數(shù)據(jù)處理和基因生物學(xué)功能的分析奠定基礎(chǔ)。通過(guò)Trinity軟件對(duì)clean data 進(jìn)行從頭組裝，共計(jì)得到 170 807條transcript，由于一個(gè)基因可能會(huì)有兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，因此取最長(zhǎng)的 transcript 作為unigene，所得的unigene總共為96 659 個(gè)。其中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本為 10 567/10 567 bp；最短的轉(zhuǎn)錄本201/201 bp；平均長(zhǎng)度為 546.83/638.86 bp；組裝轉(zhuǎn)錄本按從小到大的順序排序，當(dāng)轉(zhuǎn)錄本累加的長(zhǎng)度占總長(zhǎng)度的50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的unigene和transcript長(zhǎng)度分別為 923 bp、772 bp；當(dāng)累加轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度達(dá)到總長(zhǎng)度的90%時(shí)， 所對(duì)應(yīng)的unigene和transcript長(zhǎng)度分別為241 bp 、273 bp (表1)。如圖3所示，片段長(zhǎng)度主要集中在 200～1 000 bp之間，其中轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度在 200～300 bp之間數(shù)量最多，其次是300～400 bp，長(zhǎng)度越長(zhǎng)所占比例越小。

表1 轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布

2.3 Unigene的功能注釋

為了探究轉(zhuǎn)錄本所具有的生物學(xué)功能，對(duì)轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行基因功能注釋和分類。使用 BLAST軟件將 Unigenes 序列與NR、Swissprot、KEGG以及KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigenes 的注釋信息。長(zhǎng)瓣兜蘭花器官最終獲得注釋信息的 Unigenes 有 61 629條，占總Unigene總數(shù)的64.43%。長(zhǎng)瓣兜蘭花器官轉(zhuǎn)錄組Unigene 在 NR、KOG、Swissprot、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋的基因分別占總 Unigene的 47.64%、29.69%、54.51%、5.12%。長(zhǎng)瓣兜蘭轉(zhuǎn)錄組 Unigene 在 CDD、KOG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋的基因數(shù)目分別為 33 589、28 405、45 568、56 635、23 870、52 141、44 973、54 934、4 893。

從圖4可以看出， 長(zhǎng)瓣兜蘭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝的 Unigenes 與其他物種 的 Unigenes 相似數(shù)量最多，達(dá)到了29.42%；其次是油棕(Elaeisguineensis)，占 NR 注釋總序列的 20.54%； 海棗(Phoenixdactylifera)為第三。

在GO 注釋分析中，Unigene 序列主要分為分子功能、細(xì)胞組分、生物過(guò)程 3 個(gè)大類。從圖5可以看出，在所有差異表達(dá)基因中，參與分子功能的基因有22類，細(xì)胞組分的為22個(gè)，還有27類聚集在生物學(xué)過(guò)程中。其中，結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、 細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞 及細(xì)胞部分關(guān)聯(lián)的Unigene 較多。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄組的完整性和注釋的有效性，對(duì) Unigene 進(jìn)行KOG分類。共發(fā)現(xiàn)有 28 405 條 Unigen 得到注釋，獲得功能分類 25 個(gè)，在這些分類中，以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制類 (4 252 條)最多，一般功能預(yù)測(cè)類 (3 575條)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)最少 (31個(gè)) (圖6)。結(jié)果說(shuō)明，在長(zhǎng)瓣兜蘭花發(fā)育的過(guò)程中通過(guò)大量的生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)完成其生物學(xué)過(guò)程。

為了進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能，采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭可能參與的生理生化反應(yīng)途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)。分析結(jié)果表明，4 893 條 Unigene 得到注釋，共參與了 23 類327個(gè)代謝途徑 (圖7)，其中包含Unigene 較多的途徑有：碳水化合物代謝途徑、能量代謝途徑、脂質(zhì)代謝途徑等。代謝通路富集表明在長(zhǎng)瓣兜蘭花發(fā)育過(guò)程中，碳水化合物、能量和脂質(zhì)代謝旺盛。

2.4 基因表達(dá)分析

通過(guò)FPKM分析，長(zhǎng)瓣兜蘭花蕾和花朵均表達(dá)的基因有 61 982個(gè)，只在其花蕾期特異表達(dá)的基因有27 488 個(gè)，只在花朵中特異表達(dá)的基因有6 000個(gè)。根據(jù)差異基因篩選條件，在 2 個(gè)發(fā)育時(shí)期篩選出 6 967 個(gè)差異表達(dá)基因，其中花朵相對(duì)花蕾上調(diào)表達(dá)的有2 417個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有4 550個(gè)。在差異表達(dá)的基因中，存在大量與花發(fā)育相關(guān)的基因，但部分基因在花蕾和花朵的表達(dá)中存在顯著差異，比如，相對(duì)于長(zhǎng)瓣兜蘭花蕾期，AG基因和C2H2-ZFP基因在花朵期表達(dá)量顯著下調(diào)，而AGL80、WUS，F(xiàn)PA基因和FLC基因的表達(dá)量顯著升高(圖8)。

2.5 SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)

通過(guò)用MISA 軟件對(duì) Unigene 進(jìn)行 SSR分析，發(fā)現(xiàn)在30 709 條Unigene中共有 7 613 條有 SSR，包括了 8 160個(gè)由一至六個(gè)核苷酸重復(fù)序列組成的 SSR位點(diǎn)。SSR 豐富度依次為二核苷酸 (2 567,33.72%)、一核苷酸 (2 445,32.12%)、三核苷酸 (1 988,26.11%)、四核苷酸 (72,0.95%)、六核苷酸 (19,0.25%)和五核苷酸 (16,0.21%)。長(zhǎng)瓣兜蘭SSR特征分析為開(kāi)展長(zhǎng)瓣兜蘭及兜蘭屬植物分子標(biāo)記及遺傳圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

3 討 論

采用RNA-seq技術(shù)對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組無(wú)參基因組分析，為解析長(zhǎng)瓣兜蘭花發(fā)育及開(kāi)花的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行長(zhǎng)瓣兜蘭的花期調(diào)控和分子育種提供可利用的基因資源。

通過(guò)GO功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有54 934個(gè)Unigene得到注釋，通過(guò)分類可將其分為分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分三個(gè)類別，共71個(gè)小組，其中，結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞及細(xì)胞部分關(guān)聯(lián)的Unigene較多，這可能是由于在長(zhǎng)瓣兜蘭花芽分化進(jìn)程中細(xì)胞不斷增殖導(dǎo)致花芽?jī)?nèi)代謝活動(dòng)旺盛引起的。這與橡膠樹(shù)花序、雄蕊及雌蕊的注釋結(jié)果大致相同[11]，說(shuō)明在細(xì)胞代謝活動(dòng)比較旺盛的生殖器官發(fā)育時(shí)期，大量的功能基因處于表達(dá)狀態(tài)。

在差異表達(dá)的基因中，與花發(fā)育相關(guān)的基因主要有AG、AGL80、C2H2-ZFP、WUS、FPA以及FLC。在這些基因中，相對(duì)于長(zhǎng)瓣兜蘭花蕾期，AG和C2H2-ZFP在花朵期表達(dá)量顯著下調(diào)，而AGL80、WUS，F(xiàn)PA和FLC的表達(dá)量顯著升高。花朵時(shí)期，大量的基因表達(dá)下調(diào)，可能是由于到花朵時(shí)期，花的各個(gè)部分器官分化已完成，調(diào)控器官分化的基因已完成使命導(dǎo)致表達(dá)量下降。有研究表明，AG屬于ABC模型中C功能基因，在調(diào)節(jié)花朵個(gè)體發(fā)育的后半部分起到至關(guān)重要的作用，表現(xiàn)在調(diào)控花柱和心皮的發(fā)育以及花朵發(fā)育的終止上[12]；而C2H2-ZFP可通過(guò)影響細(xì)胞增殖和分裂過(guò)程中的激素信號(hào)，直接或間接調(diào)控花器官發(fā)育中的ABC模型功能基因[13]；WUS則對(duì)花分生組織的維持和確定性至關(guān)重要[12]；FPA蛋白組主要控制開(kāi)花時(shí)間；而FLC能抑制春化期花期的起始。在本研究中得到與花發(fā)育相關(guān)的基因在花發(fā)育過(guò)程中具體表達(dá)量如何，是如何起作用的，將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究，以更好地發(fā)掘出長(zhǎng)瓣兜蘭花發(fā)育和開(kāi)花的相關(guān)基因。

優(yōu)良品種的選育離不開(kāi)分子標(biāo)記的手段，開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記對(duì)品種的選育具有重要意義。通過(guò)表型數(shù)據(jù)的測(cè)定和觀察作為育種的主要參考依據(jù)，用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選育，可以培育出品質(zhì)更優(yōu)、表型更好的優(yōu)良品種[14]。在花卉植物中，已經(jīng)有很多植物進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，如朱頂紅[15]、百合[16]、蘭科植物寒蘭[17]、亨利兜蘭[18]以及同色兜蘭(Paphiopedilumconcolor)均進(jìn)行了分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，這對(duì)育種具有極大的意義。在本研究中，采用軟件 MISA(1.0 版)對(duì) Unigene 進(jìn)行 SSR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)7 613 條有 SSR，共搜索到8 160個(gè)SSR 位點(diǎn)，這比雜交蘭[19]中的SSR位點(diǎn)少得多。本研究雖通過(guò)軟件預(yù)測(cè)了SSR分子標(biāo)記，但在位點(diǎn)多態(tài)性方面可能還會(huì)存在差異。因此，后期還需結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SSR分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究用 Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)長(zhǎng)瓣兜蘭花器官進(jìn)行無(wú)參轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得95 659個(gè) Unigene，其中，有45 568 個(gè) Unigene 在 NR數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得注釋, 其中有9 345個(gè)Unigene注釋到油棕中；在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到54 934個(gè)Unigene，可將其分為分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分三大類和71個(gè)亞類；在KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中有28 405個(gè) Unigene 獲得注釋，可分為 25 個(gè)功能區(qū)域；KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋到的4 893 條 Unigene 參與了 23 類327個(gè)KEGG代謝途徑，可以全面了解長(zhǎng)瓣兜蘭花器官的代謝途徑信息；分析了在花蕾期和花朵期的差異表達(dá)基因，共有6 967 個(gè)差異表達(dá)基因，其中花朵相對(duì)花蕾上調(diào)表達(dá)的有2 417個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有4 550個(gè)；在長(zhǎng)瓣兜蘭花器官轉(zhuǎn)錄組中存在8 160 個(gè) SSR 位點(diǎn)。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了大量長(zhǎng)瓣兜蘭花器官基因序列信息，初步了解長(zhǎng)瓣兜蘭花器官發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)情況，這為后續(xù)進(jìn)一步深入開(kāi)展長(zhǎng)瓣兜蘭基因功能研究、花發(fā)育的分子機(jī)制及 SSR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。