李慧敏

（鄭州市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河南鄭州 450000）

1 動(dòng)物基因工程技術(shù)概述

1973年，HBoyer和Cohen及其團(tuán)隊(duì)成功進(jìn)行了體外重組實(shí)驗(yàn)，獲得了具有雙重抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子（卡那霉素和四環(huán)素），標(biāo)志著基因工程的誕生?；蚬こ淌侵釜M義的基因工程。它是指在體外剪接和重組供體基因和載體，然后將它們轉(zhuǎn)移到另一個(gè)有機(jī)體（受體），并根據(jù)人們的需要穩(wěn)定地遺傳它們，表達(dá)新的性狀或產(chǎn)生新的產(chǎn)品。重組DNA分子在受體細(xì)胞中擴(kuò)增，因此可以稱為分子克隆或基因克隆。

動(dòng)物基因工程一般包括傳統(tǒng)操作技術(shù)中的雜交技術(shù)、現(xiàn)代操作技術(shù)中的基因工程和細(xì)胞生物工程，充分體現(xiàn)了重組DNA技術(shù)的工業(yè)化設(shè)計(jì)和實(shí)際應(yīng)用，包括進(jìn)行基因重組、克隆和表達(dá)（DNA重組技術(shù)）的設(shè)計(jì)和構(gòu)建的上游技術(shù)，以及規(guī)?；囵B(yǎng)基因工程菌和提取外源基因表達(dá)產(chǎn)物并純化的下游技術(shù)。將下游操作工藝和裝備復(fù)雜化會(huì)為上游重組DNA技術(shù)帶來困難與麻煩，同理忽視上游重組的實(shí)現(xiàn)則是下游技術(shù)的桎梏——基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則。

基因工程是利用基因重組，進(jìn)行體外剪切拼接，獲得重組后的新的目的基因，然后導(dǎo)入細(xì)胞或微生物體內(nèi)并成功得到表達(dá)，從而產(chǎn)生人類需要的產(chǎn)物。

基因工程是極具理論與技術(shù)性的當(dāng)代前沿技術(shù)。設(shè)計(jì)重組和表達(dá)分別在基因水平及細(xì)胞、組織和動(dòng)物個(gè)體水平進(jìn)行的便是動(dòng)物基因工程。主要分為三大類。

1.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

人工培養(yǎng)從動(dòng)物體內(nèi)分離提取或人工構(gòu)建的目的基因，并進(jìn)行重建和擴(kuò)增，再將此目的基因?qū)胧芫言嘶蚣?xì)胞質(zhì)中，使其在受體細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定存在，移入母體，形成新個(gè)體。這種通過人工手段使其帶有人類所需的目的基因的動(dòng)物，便稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。常用技術(shù)有原核顯微注射法，轉(zhuǎn)染色體技術(shù)和細(xì)胞載體技術(shù)。

圖1 （動(dòng)物）基因工程技術(shù)基本操作程序

1.2 克隆動(dòng)物

克隆也稱核移植或無性繁殖，是使用特殊手段對處于特定發(fā)育階段的動(dòng)物細(xì)胞核供體及相應(yīng)的核受體進(jìn)行體外重組，形成一個(gè)新的完整胚，再通過胚胎移植發(fā)育成新個(gè)體，最終獲得與核供體基因型相同的新個(gè)體。

1.3 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因技術(shù)與克隆技術(shù)的有效融合，它是以動(dòng)物體細(xì)胞（包括多潛能干細(xì)胞、成體體細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞等）為受體，將目的基因通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞中，將其作為核供體，重新進(jìn)行克隆。簡單來說就是在培育得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后再進(jìn)行動(dòng)物克隆?？茖W(xué)合理地應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)能使基因轉(zhuǎn)移效率快速提高，并使后代數(shù)量短期大幅增加。

2 動(dòng)物基因工程技術(shù)在應(yīng)用方面的研究

2.1 基因工程激素

基因工程激素：通過外源投放來刺激動(dòng)物生產(chǎn)能力。如利用高效表達(dá)的大黃魚生長激素酵母工程菌制成促生長飼料并投喂，能明顯發(fā)現(xiàn)魚類生長速度加快，同時(shí)使養(yǎng)殖周期縮短，成本有效降低。

2.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

通過增加或刪除特殊DNA片段使其遺傳結(jié)構(gòu)得到修飾改變的動(dòng)物，且其發(fā)生改變的DNA可以遺傳。從1980年P(guān)almer等人為哺乳動(dòng)物受精卵注入外源基因得到生長加快的小鼠后，各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也應(yīng)勢而生。轉(zhuǎn)基因的目標(biāo)是按人類意愿獲得生產(chǎn)性能、抗病能力等更好的動(dòng)物并降低成本。目前面臨的問題是人們知道的可控制生產(chǎn)性能的基因甚少，并且通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)增強(qiáng)抗病力的方法也需要更多深入研究。

2.3 哺乳動(dòng)物遺傳育種方面

在畜牧生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對遺傳改良，加快育種進(jìn)程，及真核生物表達(dá)調(diào)控等都有所裨益。當(dāng)出現(xiàn)符合人類預(yù)想或需求的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，就能利用其優(yōu)良體細(xì)胞核作供體來克隆，再進(jìn)行量產(chǎn)，獲得更多經(jīng)濟(jì)效益。在動(dòng)物雜種優(yōu)勢上，使選育種畜的性狀穩(wěn)定得到增強(qiáng)，育種效率提高，年限縮短，為育種提供極大便利。同時(shí)，可以對家畜進(jìn)行基因工程改造，植入帶有特異抗原抗體的基因，獲得具有一定抗病、抗蟲等遺傳免疫特性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

2.4 生物制藥方面

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺可用于生產(chǎn)醫(yī)用蛋白并提高基因表達(dá)效率、經(jīng)濟(jì)有效的生物反應(yīng)器，如轉(zhuǎn)入基因、激素、酶等能得到針對某些病癥起治療作用的藥物。將目的基因?qū)塍w細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，再經(jīng)過篩選出表達(dá)量最高的進(jìn)行克隆，使后代動(dòng)物乳腺中存在高表達(dá)量的蛋白質(zhì)，這種方法即利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合克隆技術(shù)來生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器。2003年，Brophy等人通過這種方法使牛奶中β-酪蛋白含量提高了8%-20%，k-酪蛋白含量提高了兩倍。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合生物反應(yīng)器生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物制劑會(huì)有不可預(yù)想的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.5 建立動(dòng)物模型和器官移植等醫(yī)療方面

鼠是人類最常使用的動(dòng)物模型，而利用轉(zhuǎn)基因鼠可以幫助人們更深入了解復(fù)雜疾病的成因過程。已建立的疾病鼠模型包括老年癡呆癥、高血壓、動(dòng)脈硬化、器官移植方面，已有科學(xué)家成功敲除了豬的ɑ-1，3-半乳糖苷酶基因，為人類異體器官移植創(chuàng)造了可能。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類帶來便利的同時(shí)也不能忽視其俱存的問題，最重要的是由外源基因整合，載體DNA的使用及轉(zhuǎn)基因表達(dá)帶來的副作用，包括誘發(fā)基因位點(diǎn)突變或失活、致癌基因的激活等，例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)激素超常分泌。但是辨證地對待這些問題才能獲得更好的發(fā)展。未來要解決的問題主要有三個(gè)：①找到合適基因；②轉(zhuǎn)化效率低，需要足夠數(shù)量的合子才能成功獲得一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；③純合子不易得，擴(kuò)群困難，但伴隨體外受精、胚胎移植等技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)也會(huì)成為一種重要的育種手段。

2.6 胚胎克隆與體細(xì)胞克隆

將胚胎卵裂細(xì)胞（體細(xì)胞）細(xì)胞核移植入已去核的卵母細(xì)胞中，經(jīng)過融合、體內(nèi)（或體外）培養(yǎng)使其發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體即胚胎克?。w細(xì)胞克?。?。利用這兩項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)短期快速繁育優(yōu)良性狀個(gè)體，建立多個(gè)具有特定基因組的純種品系，并結(jié)合胚胎生物工程技術(shù)，能建立最優(yōu)遺傳資源保護(hù)模式，甚至為其他科學(xué)領(lǐng)域，如營養(yǎng)學(xué)、藥物學(xué)等提供良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

2.7 生物工程疫苗

以基因工程的操作過程作為基礎(chǔ)，將病原微生物（可多種）的少量DNA（或RNA）重組到載體并在原核中表達(dá)，將產(chǎn)物制成疫苗，在不引起疾病爆發(fā)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)宿主特異性重組。多效價(jià)的生物工程疫苗可同時(shí)針對多種疾病，且生產(chǎn)簡單，不用經(jīng)過病毒培養(yǎng)也能獲得病毒重組疫苗。

2.7.1 病毒活載體疫苗

2.7.1.1 痘病活載體病毒

這種疫苗宿主范圍廣，增殖速度快，且穩(wěn)定性好，可兼容大量基因，因此將痘病病毒作為載體建成疫苗操作簡單，利用率高，表達(dá)效果好。目前已成功表達(dá)的保護(hù)性抗原基因有人類免疫缺陷病毒，流感病毒，傳染性支氣管病毒，小反芻獸疫病毒等，接種后攻毒效果好。

2.7.1.2 腺病毒活載體疫苗

腺病毒同樣有宿主范圍廣，增殖速度快，穩(wěn)定性好，可容基因組大的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具備安全性好，表達(dá)的蛋白質(zhì)有天然活性的特性。可以將其用于生物工程疫苗與腫瘤的研究治療。

①皰疹病毒活載體疫苗：皰疹病毒作為活載體由于基因組較大，因此可插入多個(gè)外源基因，同時(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性黏膜免疫。目前已實(shí)現(xiàn)的有偽狂犬皰疹病毒疫苗、火雞皰疹病毒疫苗、Ⅰ型牛皰疹病毒疫苗。

②小RNA病毒活載體疫苗：近年來反向遺傳技術(shù)的快速發(fā)展也促進(jìn)了RNA病毒活載體的研究。目前正在進(jìn)行且有一定進(jìn)展的有新城疫病毒和對豬繁殖與呼吸綜合征的研究。

2.7.2 細(xì)菌活載體疫苗

2.7.2.1 沙門氏菌活載體疫苗

通過對動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可得知口服重組減毒沙門氏菌病毒疫苗（如豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬流行性腹瀉病毒，豬瘟病毒等）可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，其進(jìn)一步的研究與應(yīng)用也是未來可觀的發(fā)展方向。

2.7.2.2 乳酸菌活載體疫苗

利用乳酸菌制作活載體疫苗安全性高，生理活性好，使機(jī)體免疫水平得到調(diào)節(jié)，抗原免疫原性得以提高，且制作工藝簡單，成本低，使用方便快捷。在表達(dá)病毒、細(xì)菌等的主要保護(hù)性抗原中乳酸菌載體占得一席之地，相關(guān)研究也有不錯(cuò)的發(fā)展前景。另外也有用于構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞因子的重組活載體疫苗，如表皮生長因子，淋巴細(xì)胞趨化因子等。

2.7.2.3 李斯特細(xì)菌

能誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜和細(xì)胞免疫，可作為抗病毒（腫瘤）基因工程菌研究的理想載體?；蚬こ袒钶d體疫苗能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生多種免疫，操作簡單，安全方便，生產(chǎn)成本低，且其能有效傳遞抗原，在表達(dá)外源抗原的操作方面更具靈活性。但是選擇針對性更強(qiáng)的合適活載體才能避免潛在危險(xiǎn)與干擾，提高各種活載體系統(tǒng)的安全性、靶向性和有效性，這是今后研究的重點(diǎn)方向。

基因工程的出現(xiàn)，使針對家畜病毒性或細(xì)菌性傳染病的基因工程疫苗開始變得熱門起來。不論是乙肝炎病毒、狂犬病病毒，還是牛瘟病毒，其對應(yīng)疫苗研制都取得巨大成功。在市場需求和科技進(jìn)步的雙重推動(dòng)下，重組基因工程疫苗，將會(huì)逐漸占主導(dǎo)地位，并有重大商業(yè)價(jià)值。

2.7.3 核酸探針

探針是指可以和特定目標(biāo)強(qiáng)烈反應(yīng)并且可被檢測出的分子，而核酸探針則是通過堿基互補(bǔ)配對的方式以氫鍵與目標(biāo)結(jié)合的分子，結(jié)合力強(qiáng)，特異性高。

2.7.3.1 病原微生物的檢測方面

應(yīng)用核酸探針可以快速確定知道病原微生物特定核苷酸在受感染組織中是否存在，且制備核酸探針的DNA片段穩(wěn)定可長期保存。目前EB核酸探針，單純皰疹核酸探針，乙型肝炎核酸探針等50多種病毒核酸探針及志賀氏菌，結(jié)核分枝桿菌，致病性大腸桿菌等細(xì)菌核酸探針已用于檢測及其他應(yīng)用。

2.7.3.2 在遺傳性疾病及點(diǎn)突變的直接分析方面

當(dāng)前已有的核酸探針可進(jìn)行點(diǎn)突變的直接分析，即根據(jù)寡核苷酸鏈給定的等位基因間的一個(gè)堿基對的錯(cuò)配來鑒別其基因型。已用于鐮刀形細(xì)胞貧血癥等的研究。

2.7.3.3 用于檢測抗生素耐藥性 流行病學(xué)調(diào)查 診斷惡性腫瘤等

基因探針主要用于動(dòng)物疾病診斷，用PCR擴(kuò)增法與其相輔使用，可以推動(dòng)其實(shí)用性，經(jīng)過后續(xù)研究能逐漸達(dá)成敏感度提高，診斷成本減少等的目標(biāo)。

2.7.4 DNA指紋技術(shù)

用不同多核小衛(wèi)星（串聯(lián)重復(fù)序列）做探針進(jìn)行雜交可獲得不同雜交圖譜，不同個(gè)體圖譜上帶的位置不同，即稱DNA指紋圖。其多位點(diǎn)性、高度變異性、遺傳方式簡單的特點(diǎn)，使此技術(shù)充分利用于不同方面。良種登記、親緣鑒定、品種（系）純度測定等都可用DNA指紋技術(shù)，其在親子鑒定方面較成功。

2.7.5 預(yù)測雜種優(yōu)勢

現(xiàn)代遺傳育種中，利用雜種優(yōu)勢預(yù)測雜交模式是常用手段，利用DNA雜交，能通過品種（系）DNA指紋圖譜來分析品種間遺傳距離，方法成熟，結(jié)果可靠。當(dāng)前已有利用小衛(wèi)星探針分析了湖北豬Ⅲ（Ⅳ）系，與長白、杜洛克品種的遺傳差距，并據(jù)此得出不同經(jīng)濟(jì)性狀與雜種優(yōu)勢間的關(guān)系。

2.7.6 用于遺傳結(jié)構(gòu)分析 物種起源分化等

DNA指紋技術(shù)在分析品種（系）間遺傳距離的同時(shí)上，還可得出不同地域表型的品種（系）的遺傳分化關(guān)系，進(jìn)而能對物種資源進(jìn)行合理利用與保護(hù)。研究表明，在對波爾山羊親本及雜交后代多態(tài)性研究后發(fā)現(xiàn)其與唐山奶山羊的親緣關(guān)系較近；對江西6個(gè)地方黑豬進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，確定了不同地域豬有著相近的親緣關(guān)系，據(jù)此可劃為同一豬種。DNA指紋技術(shù)作為一門新興的遺傳標(biāo)記技術(shù)還有很大的研究空間與進(jìn)步。

2.7.7 胚胎性別鑒定

用DNA探針與Y染色體上SRY序列結(jié)合，依據(jù)雜交結(jié)果確定胚胎性別。相比于之前在胚胎上取多個(gè)細(xì)胞作為材料，現(xiàn)在使用的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)更加簡單高效，且產(chǎn)生的負(fù)面影響少。哺乳動(dòng)物的性別鑒定更加頻繁，根據(jù)需求不同，對動(dòng)物的性別要求也不同，如肉牛中偏向公牛，而奶牛則偏向母牛。

家禽繁育中，不論產(chǎn)蛋還是生肉，雛禽性別都與經(jīng)濟(jì)效益棲息相關(guān)。以產(chǎn)蛋為生產(chǎn)目標(biāo)時(shí)，母雞需求量遠(yuǎn)高于公雞，而在追求肉雞產(chǎn)品中，母雞對飼料的利用率，生命力生長速度等遠(yuǎn)不如公雞，因此對公雞需求量大。合理使用胚胎性別鑒定技術(shù)，可以針對目標(biāo)與需求更快獲得經(jīng)濟(jì)效益。隨著科技進(jìn)步與研究的深入，胚胎性別早期鑒定還可用于更多方面。

2.7.8 利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)其他物質(zhì)

（1）生長激素使胴體總能量攝入增加，但蛋白質(zhì)增加，脂肪降低，且胴體質(zhì)量、生產(chǎn)效益都明顯增加。同時(shí)使奶產(chǎn)量增加但組成不變。

（2）纖維素酶基因在酵母中表達(dá)，提供充分碳源，以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)飼料，提供廉價(jià)優(yōu)質(zhì)飼料。

（3）瘤胃微生物遺傳改造，使纖維素轉(zhuǎn)化率提高，飼料使用量降低，但微生物種類繁多，且適應(yīng)瘤胃環(huán)境程度不同，工程菌建立有一定困難，也是今后要解決的問題。

（4）利用基因工程育種技術(shù)可以培育獲得抗病蟲害、抗逆性更好，生產(chǎn)性狀、適應(yīng)性更優(yōu)良的品種，同時(shí)獲得更多高的經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)語

隨著生物科學(xué)的興起與技術(shù)的快速發(fā)展，動(dòng)物基因工程的研究也正在更進(jìn)與創(chuàng)新中慢慢進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)，并為畜禽等動(dòng)物和人類的傳染病及腫瘤防治提供更多解決方法，為人類和動(dòng)物健康與食品安全甚至社會(huì)進(jìn)步起巨大作用。但是基因工程還是一門嶄新的科技，人們需要探究與了解深入的方面還有很多，這就需要我們在研究與實(shí)踐中探索出新的道路，在保證人類及動(dòng)物健康與安全，不影響環(huán)境與現(xiàn)有生物系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，為人類帶來更高的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，堅(jiān)持辨證唯物主義的科學(xué)態(tài)度，謹(jǐn)慎嚴(yán)苛，認(rèn)真負(fù)責(zé)，從實(shí)際考慮出發(fā)，才能真正為人類謀到福祉，創(chuàng)造幸福生活。