馬超，唐華羽

佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154000

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）屬于骨科常見的一種疾病，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變、軟骨基質(zhì)出現(xiàn)降解，可激發(fā)滑膜炎及骨質(zhì)增生，繼而引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能異常，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生一定影響［1－3］。目前，臨床治療KOA的方法包括物理療法、藥物干預、針灸及運動康復等，然而上述治療方式效果并不理想。近年來隨著中醫(yī)藥在KOA治療中的應用日益廣泛，證實了補腎活血壯骨湯治療骨關(guān)節(jié)炎可發(fā)揮一定的效果［4］。另有研究顯示，關(guān)節(jié)內(nèi)局限性炎癥反應是導致骨性關(guān)節(jié)炎疼痛的重要原因，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及多種炎癥因子均在KOA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5－7］。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生也與血液流變指標異常、血液黏度增加及紅細胞變形性等密切相關(guān)。本文通過研究補腎活血壯骨湯對KOA模型大鼠血液流變學、MMP及炎性因子表達的影響，旨在分析補腎活血壯骨湯治療KOA的藥效作用。

1 材料

1.1 動物150只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量230～250 g，購自鄭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2015－0037，倫理批號：2020154。

1.2 藥物與試劑補腎活血壯骨湯方藥組成為：熟地黃9 g，補骨脂9 g，紅花1.5 g，獨活3 g，肉蓯蓉3 g，杜仲3 g，當歸3 g，沒藥3 g，山萸肉3 g，菟絲子10 g。基質(zhì)金屬蛋白酶－1（matrix metalloproteinase－1，MMP－1）、基質(zhì)金屬蛋白酶－3（matrix metalloproteinase－3，MMP－3）、基質(zhì)金屬蛋白酶－13（matrix metalloproteinase－13，MMP－13）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑－1（matrix metalloproteinase inhibitor－1，TIMP－1）、白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司，批號分別為：20180607、20180704、20180605、20180803、20180706、20180703、20180709）。

1.3 儀器TDZ5－WS型醫(yī)用離心機（湖南平凡科技有限公司）；DW－86L338型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；iMark型全自動酶標分析儀（美國Bio－Rad公司）；足底熱痛測試儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組及模型復制取150只SD大鼠，隨機分成正常組、模型組及補腎活血壯骨湯低劑量（0.010 g·kg－1）、中劑量（0.015 g·kg－1）和高劑量（0.020 g·kg－1）組，每組30只。除正常組外，其余大鼠均以關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶復制KOA模型［8］。對大鼠進行備皮及消毒處理，剃除大鼠右前肢膝關(guān)節(jié)部位及以下毛發(fā)，用75%乙醇消毒皮膚后，于右前肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%的木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2 d一次，連續(xù)注射2周。14 d后若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)下述癥狀時說明復制成功：右前側(cè)膝關(guān)節(jié)紅腫熱痛，伴有軟組織的腫脹或出現(xiàn)積液；右前側(cè)膝關(guān)節(jié)以及周圍出現(xiàn)僵硬以及活動受限；右前側(cè)膝關(guān)節(jié)病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)大量滲出液；軟骨表面不光滑，存在滑膜增生或粘連等關(guān)節(jié)炎病理改變。造模成功后第2天，除正常組與模型組以生理鹽水灌胃，其余大鼠給予相應的藥物。

2.2 觀察指標

2.2.1 測定大鼠痛閾值用足底熱痛測試儀檢測所有大鼠雙側(cè)后足趾熱痛閾值，每只大鼠均重復測量3次，取平均值，每次檢測間隔10 min，以大鼠疼痛后的嘶鳴作為達到痛閾的信號并記錄壓痛閾值。

2.2.2 觀察KOA大鼠足腫脹度及腫脹消退時間

檢測足腫脹度時，先將容量為50 mL的量筒內(nèi)添滿蒸餾水，于大鼠的右前側(cè)的膝關(guān)節(jié)縫的有關(guān)矢量面作標記，而后將溢出的水即為大鼠的足腫脹度，檢測3次，取平均值。同時記錄大鼠足腫脹消退時間。

2.2.3 檢測血液流變學指標于干預4周后，腹主動脈取血，檢測全血高切、血漿黏度。

2.2.4 檢測血清MMP及炎癥因子水平于干預4周后采集各組大鼠的股動脈血，1 500 rpm·min－1離心10 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測MMP－1、MMP－3、MMMP－13、TIMP－1、IL－6、TNF－α、IL－1β水平。

2.2.5 觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨病理變化上述檢測完成后，處死大鼠，每組隨機取3只大鼠，取關(guān)節(jié)軟骨，行常規(guī)石蠟包埋，制成5μm厚度的切片，行HE染色，在顯微鏡下觀察滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤、組織粘連及軟骨累及情況。

2.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，以（±s）表示計量資料，%表示計數(shù)資料，組間比較分別采用t及χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠壓痛閾值、足腫脹度、腫脹消退時間的影響與正常組比較，模型組壓痛閾值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血壯骨湯低、中、高劑量組大鼠壓痛閾值升高（P＜0.05），足腫脹度明顯減輕（P＜0.05），腫脹消退時間明顯縮短（P＜0.05）；與低劑量組比較，補腎活血壯骨湯中、高劑量組大鼠的壓痛閾值升高（P＜0.05），足腫脹度明顯減輕（P＜0.05），腫脹消退時間明顯縮短（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠的壓痛閾值升高（P＜0.05），足腫脹度明顯減輕（P＜0.05），腫脹消退時間明顯縮短（P＜0.05）。見表1。

表1 對大鼠壓痛閾值、足腫脹度、腫脹消退時間的影響 （±s）

表1 對大鼠壓痛閾值、足腫脹度、腫脹消退時間的影響 （±s）

注：與正常組比較，＠P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與補腎活血壯骨湯低劑量組相比，*P＜0.05；與補腎活血壯骨湯中劑量組相比，△P＜0.05

／d正常組組別 n 壓痛閾值／kPa 足腫脹度／% 腫脹消退時間30 378.26±21.33－－模型組 30 162.93±21.05＠ 48.39±3.54 10.38±2.39補腎活血壯骨湯低劑量組 30 224.91±29.40＃ 44.01±3.29＃ 7.39±1.94＃補腎活血壯骨湯中劑量組 30 285.01±31.95＃* 39.19±3.20＃* 6.41±1.25＃*補腎活血壯骨湯高劑量組 30 368.74±34.10＃*△ 32.14±2.85＃*△ 5.27±1.04＃*△

3.2 對大鼠全血高切、血漿黏度的影響與正常組比較，模型組大鼠全血高切、血漿黏度水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血壯骨湯低、中、高劑量組大鼠全血高切、血漿黏度水平均明顯降低（P＜0.05）；與補腎活血壯骨湯低劑量組相比，中、高劑量組大鼠全血高切、血漿黏度水平均明顯降低（P＜0.05）；與補腎活血壯骨湯中劑量組比較，高劑量組大鼠全血高切、血漿黏度水平均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

3.3 對大鼠血清各項MMPs水平的影響與正常組比較，模型組MMP－1、MMP－3、MMP－13水平明顯升高，TIMP－1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血壯骨湯低、中、高劑量組MMP－1、MMP－3、MMP－13水平均明顯降低，TIMP－1水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，補腎活血壯骨湯中、高劑量組MMP－1、MMP－3、MMP－13水平明顯降低，TIMP－1水平升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，補腎活血壯骨湯高劑量組MMP－1、MMP－3、MMP－13水平均降低，TIMP－1水平升高（P＜0.05）。見表3。

表2 對大鼠全血高切、血漿黏度的影響（±s）

表2 對大鼠全血高切、血漿黏度的影響（±s）

注：與正常組相比，＠P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與補腎活血壯骨湯低劑量組相比，*P＜0.05；與補腎活血壯骨湯中劑量組相比，△P＜0.05

組別 n 全血高切／mPa·s－1血漿黏度／mPa·s－1 30 4.17±0.45 0.79±0.11模型組 30 5.75±0.65＠ 1.35±0.23＠補腎活血壯骨湯低劑量組30 5.36±0.59＃ 1.14±0.19＃補腎活血壯骨湯中劑量組30 4.68±0.54＃* 0.95±0.14＃*補腎活血壯骨湯高劑量組30 4.20±0.48＃*△ 0.84±0.12＃正常組*△

3.4 對大鼠血清炎癥因子水平的影響與正常組比較，模型組大鼠的IL－6、TNF－α、IL－1β水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血壯骨湯低、中、高劑量組IL－6、TNF－α、IL－1β水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，補腎活血壯骨湯中、高劑量組IL－6、TNF－α、IL－1β水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，補腎活血壯骨湯高劑量組IL－6、TNF－α、IL－1β水平均明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表3 對大鼠血清各項MMPs水平的影響 （±s，μg·L－1）

表3 對大鼠血清各項MMPs水平的影響 （±s，μg·L－1）

注：與正常組比較，＠P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與補腎活血壯骨湯低劑量組相比，*P＜0.05；與補腎活血壯骨湯中劑量組相比，△P＜0.05

MMP－1 MMP－3 MMP－13 TIMP－1正常組 30 68.37±15.92 2.91±0.33 33.44±8.38 7.28±0.組別 n 57模型組 30 102.11±18.74＠ 4.20±0.61＠ 56.20±10.28＠ 5.70±0.34＠補腎活血壯骨湯低劑量組 30 95.23±15.23＃ 3.81±0.52＃ 44.29±9.48＃ 6.23±0.49＃補腎活血壯骨湯中劑量組 30 87.37±12.39＃* 3.41±0.44＃* 40.01±6.10＃* 6.84±0.72＃*補腎活血壯骨湯高劑量組 30 71.04±12.04＃*△ 3.21±0.34＃*△ 35.10±7.13＃*△ 7.20±0.91＃*△

表4 對大鼠血清炎癥因子水平的影響 （±s，ng·L－1）

表4 對大鼠血清炎癥因子水平的影響 （±s，ng·L－1）

注：與正常組比較，＠P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與補腎活血壯骨湯低劑量組相比，*P＜0.05；與補腎活血壯骨湯中劑量組相比，△P＜0.05

組別 n IL－6 TNF－α IL－1β 30 21.72±1.83 23.37±5.78 5.88±1.20模型組 30 40.91±6.12＠ 39.59±10.29＠ 11.42±2.39＠補腎活血壯骨湯低劑量組 30 36.23±4.20＃ 31.47±9.72＃ 9.15±1.57＃補腎活血壯骨湯中劑量組 30 30.01±3.71＃* 27.03±6.02＃* 7.01±1.42＃*補腎活血壯骨湯高劑量組 30 22.87±2.85＃*△ 24.01±5.81＃*△ 6.14±1.20＃正常組*△

3.5 觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨病理變化正常組的大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無退行性病變，無滑膜組織增生；模型組大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細胞明顯增多，滑膜細胞增多，伴體積增大，滑膜增厚，滑膜下可見明顯組織水腫，基質(zhì)淡染；補腎活血壯骨湯低劑量組大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性物質(zhì)略有減少，軟骨表面較模型組稍平整光滑，滑膜組織增生略微減輕；補腎活血壯骨湯中劑量組大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性物質(zhì)減少，軟骨表面平整光滑，滑膜組織增生減輕；補腎活血壯骨湯高劑量組大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性物質(zhì)明顯減少，軟骨表面平整光滑，滑膜組織增生顯著減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠的關(guān)節(jié)腔病理圖（HE，×200）

4 討論

中醫(yī)認為KOA屬于“痹癥”范疇，該病和年老體衰、外感風寒濕邪及長期勞損等密切相關(guān)，其病機主要為本虛標實，且以腎虛為本、血瘀為標，腎虛血瘀貫穿于骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程［9－11］。中醫(yī)藥治療KOA有明顯的優(yōu)勢，受到廣泛的關(guān)注［12－14］。有研究顯示，中醫(yī)藥可通過改善局部微循環(huán)，抑制氧自由基的產(chǎn)生，促進軟骨局部膠原及蛋白多糖的合成等途徑減輕骨關(guān)節(jié)炎病理變化，從而延緩疾病的進展［15－17］。補腎活血壯骨湯的組成為熟地黃、補骨脂、紅花、獨活、肉蓯蓉、杜仲、當歸、沒藥、山萸肉及菟絲子。其中熟地黃補血養(yǎng)陰，填精益髓；杜仲補益肝腎、強筋健骨；菟絲子補益肝腎；當歸活血化瘀；沒藥散瘀止痛，消腫生肌；山萸肉補益肝腎；紅花活血通絡(luò)；獨活祛風除濕；肉蓯蓉補益肝腎；補骨脂補腎壯陽、健脾和胃；諸藥合用，共奏補腎活血、益氣壯骨之功［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)補腎活血壯骨湯治療后，大鼠的全血高切、血漿黏度水平均明顯降低，還可提高大鼠壓痛閾值，減輕足腫脹度，縮短腫脹消退時間，上述變化隨藥物劑量的增加逐漸明顯，可能是方中紅花具有活血通絡(luò)的功效，杜仲發(fā)揮強筋健骨的功效，菟絲子和山萸肉具有補肝益腎的作用，補骨脂與熟地黃相配伍，發(fā)揮補血益腎的功效，獨活具有通絡(luò)鎮(zhèn)痛的作用，沒藥可改善軟骨細胞功能，諸藥共用可增加關(guān)節(jié)液分泌，促進組織局部血液、淋巴循環(huán)，加快局部代謝，并緩解肌肉、韌帶、關(guān)節(jié)囊的攣縮［19－21］。此外，MMP－1及MMP－13屬于膠原酶，可對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原起到降解作用，MMP－3則被稱為間質(zhì)溶解素，主要對Ⅳ型膠原、明膠、糖蛋白及蛋白聚糖等物質(zhì)進行水解，而TIMP－1通過與MMPs形成復合物，繼而抑制部分的MMPs的低分子生理性抑制劑。正常生理狀態(tài)下，MMP及TIMP存在動態(tài)平衡，在維持軟骨細胞生理功能方面起著至關(guān)重要的作用［22－24］，當兩者的平衡被打破，會促進軟骨退變的發(fā)生，進一步導致KOA［25－27］。本研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血壯骨湯可改善大鼠血清MMP－1、MMP－3、MMP－13及TIMP－1水平，且隨藥物劑量的不斷增加，上述指標改善程度越明顯，說明補腎活血壯骨湯在改善大鼠MMP方面效果明顯，提示補腎活血壯骨湯治療KOA的可能機制與維持MMP、TIMP平衡有關(guān)。另外，補腎活血壯骨湯可降低大鼠的血清IL－6、TNF－α、IL－1β水平，且與藥物劑量明顯相關(guān)，這與張峰［28］的研究結(jié)果相似。IL－6具有促進TIMP合成、分泌的作用，繼而促進軟骨細胞的增殖；而IL－1β可促進MMP基因的表達，并刺激軟骨細胞及滑膜細胞產(chǎn)生一氧化氮，進一步引發(fā)炎癥反應；TNF－α則可刺激滑膜細胞分泌前列腺素E2，從而刺激MMP的產(chǎn)生，促進軟骨的吸收，提示補腎活血壯骨湯的治療機制可能和抑制炎癥因子水平有關(guān)［29－30］。病理結(jié)果顯示，隨著補腎活血壯骨湯劑量的增加，大鼠關(guān)節(jié)滑膜細胞、炎性浸潤及組織粘連改善程度提高，充分證實了該藥應用于KOA模型大鼠的有效性。

綜上所述，補腎活血壯骨湯治療KOA模型大鼠的效果明顯，可顯著改善血液流變學，治療效果和補腎活血壯骨湯的劑量有關(guān)，即高劑量改善效果更明顯，其療效機制可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶及炎性因子有關(guān)。