陳秋平，林心健，李申蘭，劉合生，戚向陽

（浙江萬里學(xué)院食品系，浙江寧波 315100）

藤茶，是一種古老的藥食兩用植物，已被批準(zhǔn)為新資源食品，它具有抗菌消炎、降血脂、抗氧化等多種功效[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜的抗癌作用，對肝癌細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著[3-5]。龔金炎等[6]研究發(fā)現(xiàn)藤茶提取物及其主要活性單體二氫楊梅素對前列腺癌PC-3 細(xì)胞有明顯的抑制作用，但其主要活性因子二氫楊梅素對PC-3 細(xì)胞的作用弱于藤茶提取物，表明藤茶中可能存在其他活性因子，其與DMY 有協(xié)同增效的作用。天然植物中的活性成分是混合存在的，許多純化后的單體的活性弱于天然植物的粗提物，其活性可能是不同功能因子相互作用的結(jié)果。藤茶中的主要活性成分為二氫楊梅素（DMY）、楊梅苷（MYT）、楊梅素等[7-8]，含量約為0.3%～34.19%、0.07%～1.71%、0.0007%～0.33%[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)DMY 和MYT 能夠誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞的增殖[12-13]，基于天然產(chǎn)物整體觀，本試驗主要探究藤茶中的主要黃酮DMY 和MYT 之間的聯(lián)合作用，探索二者聯(lián)用對HepG2 細(xì)胞增殖的協(xié)同作用，以期確定二者的最佳配比，為藤茶的后續(xù)研究以及開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2 細(xì)胞 上海細(xì)胞庫；胎牛血清 北京全式金生物技術(shù)有限公司；RPMI 培養(yǎng)基、胰蛋白酶Hyclone 公司；Hoechst33342 染色液 碧云天生物技術(shù)公司；二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品、楊梅苷標(biāo)準(zhǔn)品、四甲基偶氮唑鹽（MTT）北京索萊寶科技有限公司。

MCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋；MLS-3751L 高壓蒸汽滅菌鍋 日本松下；HFsafe-1500 生物安全柜 力康儀器有限公司；5804R 離心機(jī) 愛本德中國有限公司；DNP-9272A 恒溫培養(yǎng)箱 上海賀德實驗設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀 瑞士TECAN；Ts2R 倒置熒光顯微鏡 日本尼康。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 在無菌條件下，將HepG2 細(xì)胞接種于含10% FBS 的RPIM-1640 培養(yǎng)基中，于溫度為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞生長密集時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)[14]。

1.2.2 MTT 法測定細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞鋪板及給藥：將HepG2 細(xì)胞消化后，以3000 cell/孔的密度接種至96 孔板，細(xì)胞貼壁后給藥。將DMY 和MYT用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol/L 的母液，使用時用培養(yǎng)基稀釋，以獲得所需的濃度，并保證DMSO 的最終濃度在培養(yǎng)基中小于0.5%。為了評價DMY 和MYT 的聯(lián)合作用，使細(xì)胞抑制率能更合理分布將細(xì)胞用DMY（20、40、60、80 和100 μmol/L），MYT（20、50、100、200 和300 μmol/L），以及DMY和MYT 配伍組（以DMY 為固定濃度10、20、30、40、50 μmol/L，MYT 按DMY:MYT 分別為1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1 的比例加入；當(dāng)DMY:MYT=1:4 時，若DMY 仍以10～50 μmol/L 的濃度，細(xì)胞抑制率偏高，因此調(diào)整DMY 濃度為5、10、15、20、25 μmol/L，MYT 按DMY:MYT 為1:4 的比例加入）處理72 h，每個樣品5 個復(fù)孔。每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，將細(xì)胞繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心后，小心吸棄培養(yǎng)基，每孔中加入150 μL的DMSO，避光振蕩10 min 使晶體溶解，490 nm 處測定其吸光度，計算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率（%）=1-OD樣品/OD空白對照×100%[15]。

1.2.3 細(xì)胞Hoechst 熒光染色 HepG2 細(xì)胞懸液均以3×104cell/孔的密度接種于24 孔板中，24 h 后，待細(xì)胞在24 孔板中貼壁后，加入單體或合用單體的使其在培養(yǎng)基中的濃度為60 μmol/L，培養(yǎng)72 h 后，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2～3 次，每孔加入Hoechst 33342 染色液400 μL，染色20～30 min 后，棄染色液，用PBS 洗滌3 次后進(jìn)行熒光拍照[16]。

1.2.4 協(xié)同作用分析 合用指數(shù)（CI）可通過IC50值的計算進(jìn)一步對兩種樣品的協(xié)同、拮抗或相加效應(yīng)進(jìn)行分析[17-18]。將單體或合用單體對細(xì)胞抑制率用Calcusyn2.0 軟件進(jìn)行分析，計算DMY 和MYT在單用和聯(lián)用時各自的IC50值和樣品的CI 值。

以DMY 和MYT 兩種樣品的IC50分別為X、Y 值，作直線連接DMY 和MYT 單用時的IC50值，此直線即為等效線，然后分別以DMY 和MYT 聯(lián)用時細(xì)胞抑制率為50%時，兩個單體的濃度為橫縱坐標(biāo)繪制不同的點，若此點在等效線下方則為協(xié)同作用，落在線上則為相加作用，在等效線上方則為拮抗作用[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Calcusyn2.0 軟件對DMY 和MYT 的合用指數(shù)進(jìn)行分析，并使用Origin 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫楊梅素和楊梅苷對HepG2 腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

由圖1 可知，DMY 和MYT 單一作用下均可抑制HepG2 細(xì)胞的增殖，呈劑量依賴效應(yīng)。DMY 對HepG2 細(xì)胞的IC50為56.46 μmol/L；MYT 對HepG2細(xì)胞的IC50為95.01 μmol/L，表明DMY 對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于MYT。

圖1 二氫楊梅素和楊梅苷對HepG2 細(xì)胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of dihydromyricetin and myricetin on HepG2 cell proliferation

2.2 二氫楊梅素和楊梅苷聯(lián)用對HepG2 腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖2 所示，DMY 和MYT 分別以 1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1 的比例作用于HepG2 細(xì)胞時，隨著混合單體濃度的提高，細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸提高，呈劑量依賴效應(yīng)，IC50如表1 所示，當(dāng)混合單體DMY:MYT=1:4 時，IC50最高，為73.00 μmol/L，介于DMY 和MYT 之間；1:2～8:1 混合單體的IC50均低于DMY 和MYT，提示混合單體對HepG2的抑制作用強(qiáng)于單一單體，表現(xiàn)出明顯協(xié)同作用，其中DMY:MYT=1:1 組的IC50最小，為40.90 μmol/L，分別是DMY 和MYT 單獨作用時的72.4%和43.0%，這可能是由于DMY 和MYT 對HepG2 細(xì)胞的不同通路和靶點，實現(xiàn)了藥效協(xié)同，二者聯(lián)用能夠在降低劑量的同時保證效果。

圖2 不同配比的二氫楊梅素和楊梅苷對HepG2 細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different ratio of dihydromyricetin and myricetin on HepG2 cell proliferation

表1 不同樣品對HepG2 作用的IC50Table 1 IC50 value of different sample on HepG2 cell

進(jìn)一步的熒光染色結(jié)果顯示（圖3），HepG2 細(xì)胞給藥72 h 后，與空白對照組相比，給藥組細(xì)胞數(shù)量明顯降低，細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，表明其能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其中聯(lián)合用藥組的細(xì)胞數(shù)與DMY 相近，MYT 對細(xì)胞的作用效果較其他組弱。

圖3 熒光染色法評價混合單體對細(xì)胞增殖的協(xié)同作用Fig.3 Evaluation of mixeddrugs synergy on cell proliferation by fluorescence staining

2.3 二氫楊梅素和楊梅苷對HepG2 細(xì)胞增殖的協(xié)同作用分析

CI 值常用于評價單體協(xié)同的效果，其值為0.3～0.7 時為協(xié)同作用，0.7～0.85 為中等協(xié)同作用，0.85～0.90 為弱協(xié)同作用。根據(jù)單體和混合單體對HepG2 腫瘤細(xì)胞的作用，采用Calcusyn2.0 軟件計算得到二者的在HepG2 腫瘤細(xì)胞IC50處的CI 值，如圖4 所示，當(dāng)二者按1:4～8:1 的配伍比例時，隨著混合物中DMY 的比例增加，CI 值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當(dāng)二者比例為1:2～1:1 時呈現(xiàn)協(xié)同作用，2:1～8:1 時呈中等協(xié)同作用，1:4 時為弱協(xié)同作用。

圖4 合用指數(shù)法評價混合單體抑制HepG2細(xì)胞增殖的協(xié)同作用Fig.4 Evaluation of mixed drugs synergy on HepG2 cell proliferation by Combination index

等效曲線法分析評價二者的協(xié)同作用，結(jié)果如圖5 所示，1:4～8:1 的混合單體的點均落在等效曲線下方，提示二者呈現(xiàn)協(xié)同作用。

圖5 等效線法評價混合單體抑制HepG2細(xì)胞增殖的協(xié)同作用Fig.5 Evaluation of mixed drugs synergy on HepG2 cell proliferation by isobole analyse

3 討論與結(jié)論

近年對藤茶的研究，大多集中在其主要活性因子DMY，它具有多種生理活性，包括抗炎、降脂、抗癌等作用[21-22]，尤其是對不同的腫瘤細(xì)胞，呈現(xiàn)出廣譜抗癌特性[6,13,23-24]。由于機(jī)體代謝是非常復(fù)雜的過程，攝入的不同物質(zhì)間存在相互影響，進(jìn)而引起藥效的改變。我國中醫(yī)中藥常將多種藥材聯(lián)合使用，組成復(fù)方，實現(xiàn)藥效協(xié)同，從而達(dá)到對疾病有效治療[25]。徐容容等[12]研究發(fā)現(xiàn)楊梅素和MYT 聯(lián)用后對可以有效提升對人前列腺癌細(xì)胞系PC-3 的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。江湧等[26]研究發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚、丁香酸聯(lián)用較單獨的化合物更能有效地保護(hù)PC12 細(xì)胞免受淀粉樣蛋白毒性損傷。Tomas-Hernández 等[14]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和槲皮素聯(lián)用時，能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的自噬，并影響了促凋亡信號傳導(dǎo)。但是這些研究只是對成分的作用效果進(jìn)行簡單的加減比較，并未進(jìn)行科學(xué)的計算分析評價成分間的協(xié)同作用。CI 值近年常用于的評價藥效協(xié)同作用，當(dāng)其小于1 時，表明存在協(xié)同作用[27]。本試驗為了更準(zhǔn)確評價DMY 和MYT 間的協(xié)同作用，設(shè)置了1:2～8:1 梯度濃度，分析二者對HepG2 增殖的相互影響，結(jié)果表明該濃度范圍內(nèi)，CI 值均小于1，當(dāng)二者比例為1:1 時，CI 最低為0.6，呈現(xiàn)協(xié)同作用。等效曲線法是另一種常用的藥效協(xié)同評價方法，結(jié)果也進(jìn)一步證實了DMY 和MYT 存在藥效協(xié)同，二者聯(lián)用，對HepG2 抑制達(dá)到相同效果時，混合單體的用量可以低于單一藥物，可以達(dá)到減少劑量，降低成本的效果。腫瘤是機(jī)體多途徑失調(diào)的復(fù)雜疾病，對于它的治療也有很多不同靶點，不同的活性分子組合后，可實現(xiàn)多靶作用，提高藥效，降低藥量，但是組合物的協(xié)同機(jī)理較復(fù)雜，有關(guān)DMY 和MYT 的協(xié)同的機(jī)理仍需后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

二氫楊梅素及楊梅苷對HepG2 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，二者聯(lián)用時可明顯提升對HepG2 細(xì)胞活力的抑制作用。CI 值法和等效曲線法均表明DMY:MYT 在1:4～8:1 呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，其中當(dāng)濃度比 DMY:MYT=1:1 時，協(xié)同作用最強(qiáng)。這為藤茶的功能的進(jìn)一步探究和應(yīng)用提供了新的思路。