林海，李真，董穎博，李冰，賀銀海

(1.北京科技大學環(huán)境工程系，北京，100083；2.北京科技大學工業(yè)典型污染物資源化處理北京市重點實驗室，北京，100083)

近年來，國內工業(yè)飛速發(fā)展，礦山開采、金屬冶煉等行業(yè)向水體中排放多種重金屬，造成了嚴重的復合重金屬污染。攀鋼集團在釩生產過程中每年產生提釩廢水約8.5 萬t，其中V 和Cr 濃度超過排放標準幾十到幾百倍、甚至上千倍[1]；攀枝花巴關河渣場附近淺層地下水V 質量濃度超過飲用水源地標準(50 μg/L)近300倍，Cd質量濃度超過國家地下水質量標準Ⅴ類(0.01 mg/L)近4 倍[2-4]。鎘是有毒重金屬，為生物生長非必需元素；微量釩對生物體有益，但其化合物毒性隨釩的價態(tài)升高而增大，對生物有害[5]。重金屬在食物鏈中層層積累，位于頂端的人類深受其害[6]。

較為傳統(tǒng)的水體中重金屬污染治理方法有化學沉淀法、電化學法、吸附法和膜分離法等，但均存在一定的局限性，如化學沉淀會產生二次污染、電化學法耗電量巨大、膜分離法價格昂貴等[7]。近年來，微生物吸附法的研究十分熱門，細菌已被認為是用于金屬修復的最重要的生物吸附劑之一[8]。微生物法有操作簡便、經濟實惠等優(yōu)點，且在處理低濃度重金屬廢水方面具有良好的發(fā)展前景[9-12]。通過向培養(yǎng)基中加入高濃度重金屬，可以分離得到自然界中對該種重金屬有一定修復潛力的菌株[13]。LIMCHAROENSUK 等[14]向營養(yǎng)肉湯中加入重金屬，在泰國鋅礦土壤樣品中篩選出3株對重金屬有吸附能力的菌，對Cd2+和Zn2+的去除率分別可達74.2%和78.3%。

微生物對重金屬污染起到修復作用主要是利用加入水中的微生物菌體進行吸附。若加入菌體為活細胞，則主要為以下3個過程：1)在細胞表面吸附；2)微生物分泌胞外聚合物(EPS)與重金屬離子結合；3)依賴代謝的生物積累[15]。去除過程若不依賴于細胞的新陳代謝，則靜電吸附起到很重要的作用，菌體表面的基團與金屬離子互相吸引達到吸附的效果；若依賴于細胞的新陳代謝，細菌則會將重金屬轉運至細胞內積累，在代謝過程中還可能會對重金屬進行價態(tài)的改變。將釩的價態(tài)降低再進行沉淀是有前景的修復策略[16]。YELTON等[17]研究表明：五價釩被微生物吸收后可以通過其電子傳遞進行還原，也可通過其他電子受體的還原酶作用還原為四價釩并沉淀，在釩污染的地下水中加入乙酸鹽，釩去除率可以達到99%。

目前，研究者多對單種重金屬進行治理，針對重金屬釩鎘復合污染水體微生物修復的研究較少。基于此，本文作者從受重金屬污染的土壤中篩選出對V 和Cd 具有修復效果的菌種，通過條件優(yōu)化實驗得到該菌種在水體釩鎘污染修復中最佳的應用條件，通過傅里葉轉換紅外線光譜分析得到在重金屬去除過程中發(fā)揮重要作用的官能團，以期為微生物處理重金屬污染水體提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及培養(yǎng)基

受釩和鎘污染的土壤采自湖北省某石煤釩礦冶煉廠周邊土壤(V 和Cd 的質量分數(shù)分別為1 171.0×10-6和1.52×10-6)，從該土壤中進行菌株分離。試驗中，以LB 培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，加入CdCl2·2.5H2O及NaVO3，配置成重金屬元素質量濃度為10 g/L的重金屬儲備液作為選擇培養(yǎng)基；選用休和利夫森二氏培養(yǎng)基、甲基紅培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基用于菌株的生理生化性質鑒定試驗。

1.2 主要儀器

采用冷凍離心機(湖南平凡科技有限公司生產)進行細菌培養(yǎng)液固液分離；采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心生產)測定重金屬質量濃度；采用冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司生產)冷凍干燥離心所得菌體，以便進行傅里葉紅外光譜測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的篩選及鑒定

采用涂布平板法在含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和100 mg/L VO-3的土壤上清液中選擇培養(yǎng)耐釩、鎘菌種，劃線培養(yǎng)單個菌落并純化4代；將所得菌株接種于含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和418 mg/L VO-3的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測定剩余重金屬質量濃度，得到具有修復能力的菌株[18]。

對所篩選出的菌株進行生理生化性質實驗[19]，包括革蘭氏染色、甲基紅試驗、葡萄糖產酸試驗、蔗糖產酸試驗、淀粉水解試驗和質量濃度0.1 g/mL NaCl 生長試驗；由南京思普金生物科技有限公司對效果最佳的株菌進行分子生物學鑒定，所得序列結果在EzTaxon中進行分析比對，調取與之同源性較高的菌種16S rRNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株的應用條件優(yōu)化

按照燕傳明等[20]所用試驗方法并在其基礎上進行修改，將具有修復能力的菌株活化后加入含有10 mg/L Cd(Ⅱ)和300 mg/L VO-3的LB 液體培養(yǎng)基中，測定不同培養(yǎng)時間下剩余重金屬質量濃度，得到最佳吸附時間；考察不同釩初始質量濃度、鎘初始質量濃度、溫度、pH 對菌株去除2 種重金屬效果的影響，通過單因素試驗確定最佳應用條件。

1.3.3 菌體的紅外吸收光譜研究

取重金屬吸附前后菌液各50 mL，離心后將菌體進行冷凍干燥，由北京中科百測技術服務有限公司測定菌體的傅里葉轉換紅外光譜。

2 結果與討論

2.1 菌種的篩選及鑒定

從土壤中共分離出10 株菌落形態(tài)各不相同的菌株，進一步經含有釩、鎘的培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)后，篩選并純化出4株去除效果良好的菌，其生理生化性質如表1所示。從表1可見，4 株菌均為革蘭氏陰性菌。有研究表明革蘭氏陰性菌細胞表面含有脂多糖，且?guī)в胸撾娦裕軌蛭街亟饘訇栯x子，有利于重金屬修復[20]，株菌VCR01，VCR02 和VCR04 為發(fā)酵型，隔絕氧氣的情況下能夠利用葡萄糖、蔗糖產生有機酸，在實際應用中，較深層水體中含氧量較低，發(fā)酵型菌株能使環(huán)境中pH降低，導致細菌表面的官能團質子化，從而會促進陰離子金屬物質的吸附過程，這對水中VO-3的去除有良好效果[15]。

表1 菌株菌落形態(tài)及生理生化性質Table 1 Colony morphology and physiological and biochemical properties of screened bacterial

4 株菌的重金屬去除效果如圖1所示。從圖1可知：4株菌對重金屬的去除率均在38%以上；細菌去除重金屬能力從大到小依次為VCR02，VCR04，VCR01，VCR03。由于重金屬毒性、菌株吸附機理的不同，許多研究者證明同一菌株對不同重金屬的去除效果也會存在差異[14,20]。從圖1還可以看出：菌株VCR03對V和Cd的去除率均不高，分別為25.74%和13.24%，其原因是細菌表面所帶基團可能不利于重金屬吸附，同時還可能與其自身不能產酸有關[21]；菌株VCR01 對V 的去除率達到32.58%，對Cd的去除率僅為19.22%，表明該菌株對V 有較好的修復效果；菌株VCR04 則正好相反，能夠去除45.05%的Cd，而V的去除率卻僅有23.26%；菌株VCR02 對V 的去除率達38.00%、對Cd 的去除率達47.15%，且菌液變藍，證明在微生物生長過程中還原了VO-3。

圖1 篩選菌株對重金屬V和Cd的去除率Fig.1 Removal rate of heavy metals V and Cd by screening strains

對菌株VCR02 進分子生物學鑒定，將16S rRNA 序列在EzTaxon 中進行分析比對，該菌株最大與Bacillus toyonensis有99.79%的同源性。選取同源性相近的菌株構建菌株VCR02的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明菌株VCR02 與Bacillus fungorum距離較近，可以判斷其屬于芽孢桿菌菌屬，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 菌株VCR02系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain VCR02

2.2 菌種的應用參數(shù)對重金屬去除效果的影響

2.2.1 吸附時間對重金屬去除率的影響

菌株在培養(yǎng)0～48 h 的生長曲線及對重金屬的去除率如圖3所示，圖中，吸光度在600 nm 波長處測得。從圖3可以發(fā)現(xiàn)：隨著生長時間的延長，2 種重金屬的質量濃度均呈下降趨勢。在培養(yǎng)基pH 小于7 的酸性環(huán)境下，細菌表面的基團會發(fā)生質子化，與負離子(VO-3)相吸引[15]，因此，在接種菌液后的短時間內V 剩余質量濃度迅速下降。在細菌生長過程中，大量V 被還原[22]，在此階段內，H+與Cd2+競爭結合位點[23]，故Cd 質量濃度未有明顯變化。培養(yǎng)11 h時，菌液中V的質量濃度基本趨于穩(wěn)定，此時菌液的顏色微微變藍。ORTIZBERNAD 等[24]發(fā)現(xiàn)細菌可以通過耦合有機物的氧化獲得生長能量化合物還原VO-3，VO-3作為電子受體被還原到4 價，存在形式可能為氧釩離子(VO2+)；Cd的質量濃度也呈對數(shù)降低，因為此階段細菌的生物量變大，其表面大多數(shù)基團(羧基、巰基、磷?；?可以與Cd2+進行結合[15]，達到去除重金屬的效果。在培養(yǎng)24 h時，2種菌的菌液均已明顯變?yōu)樗{綠色，V的剩余質量濃度趨于穩(wěn)定，達到33.20%的去除率，Cd剩余質量濃度降低至基本不變，去除率為30.73%。HUANG等[23]發(fā)現(xiàn)：細菌在吸附重金屬過程中，已經吸附的重金屬離子也會再脫附。從圖3也能看出：吸附24 h后，鎘濃度有所回升，綜合分析認為，菌株VCR02 對2 種復合重金屬的最佳吸附時間為24 h。

圖3 細菌生長量和重金屬剩余質量濃度隨時間變化Fig.3 Bacterial growth and residual mass concentration of heavy metals over time

2.2.2 釩初始質量濃度對重金屬去除率的影響

釩初始質量濃度對重金屬去除的影響如圖4所示。從圖4可知：隨著VO-3加入量增大，釩的去除率上升，在釩初始質量濃度200 mg/L 的條件下，去除率最大，達到34.15%；但釩的質量濃度對自身的去除無太大影響。這可能是因為去除培養(yǎng)基中的VO-3不是單純地依靠吸附作用，而是首先要對VO-3進行還原，但細菌的生長量有限，能夠轉移的電子也有限，從而限制去除率的提高。

圖4 釩初始質量濃度對重金屬去除率的影響Fig.4 Effects of V mass concentration on removal rate of heavy metals

釩初始質量濃度對于鎘的去除有較明顯的影響，VO-3質量濃度為50 mg/L 時，鎘的去除率最高，達到53.63%，隨著釩初始質量濃度的增加，去除率下降。這可能是因為大量VO-3在進入液體后，細菌表面基團質子化，占據了原本能夠與Cd2+結合的位點，導致鎘吸附量下降。

2.2.3 鎘初始質量濃度對重金屬去除率的影響

在釩初始質量濃度為200 mg/L 時，鎘初始質量濃度對重金屬去除率的影響如圖5所示。從圖5可見：當Cd2+初始質量濃度為10 mg/L時，Cd的去除率最高，達44.91%；當Cd2+初始質量濃度為15 mg/L 時，V 去除率最高，達到40.27%。在Cd初始質量濃度為5 mg/L 時，2 種重金屬去除率最高，V去除率達38.23%，Cd去除率達44.15%。

圖5 鎘初始質量濃度對重金屬去除率的影響Fig.5 Effects of Cd mass concentration on removal rate of heavy metals

Cd2+的吸附主要靠胞外吸附[23]，污染物濃度增大能夠提高吸附推動力，一定程度上能增大去除率，這與李蘭松等[25]得到的試驗結果相同，而Cd2+的去除占據了質子化后能與VO3-結合的基團，故Cd的去除率降低才能使V的去除率升高。

鎘具有毒性，濃度過高會對微生物生長產生毒害作用，限制微生物生長，胞外吸附和胞內吸附都會被抑制，降低去除率。KIRILLOVA 等[26]發(fā)現(xiàn)：在Cd2+初始質量濃度為5 mg/L 時，已經對乳酸菌生長有所抑制，達到10 mg/L時，細菌幾乎不生長。從圖5也可以看到，Cd 質量濃度過高重金屬去除率下降的趨勢。

2.2.4 溫度對重金屬去除率的影響

在不同溫度條件下菌株VCR02 對重金屬的去除效果如圖6所示，從圖6可見：Cd的去除效果幾乎不受溫度的影響。有研究者發(fā)現(xiàn)，微生物吸附水體中的Cd2+無論是活細胞或是死細胞都有吸附效果[20,23]，因此，在較高溫度下，雖然微生物生長代謝受限，對Cd 的去除效果影響不大。相反地，溫度對釩的去除影響較為明顯，這也證明了VO-3的去除需要先進行還原，而溫度影響細菌的還原過程，從而溫度過高或過低對去除效果均有負面影響。在30℃的條件下，2種重金屬去除率均達最高點，Cd去除率達44.15%，V去除率達34.15%。

圖6 溫度對重金屬去除率的影響Fig.6 Effects of temperature on removal rate of heavy metals

2.2.5 pH對重金屬去除率的影響

pH對重金屬去除率的影響如圖7所示。從圖7可見：2 種重金屬去除率為拮抗趨勢，pH 為7 時，鎘去除率最高達到44.15%，此時，V去除率最低。

圖7 pH對重金屬去除率的影響Fig.7 Effects of pH on removal rate of heavy metals

Cd 去除率隨pH 增加呈先上升再下降的趨勢，該趨勢與多位研究者研究陽離子重金屬吸附所得到的結果[23,27-28]相同。這是因為在低pH下，生物吸附劑表面的基團質子化，H+與Cd2+競爭結合位點[26]；在高pH下，去除率降低可能與Cd的形態(tài)有關，如不易形成Cd(OH)2使其得以去除[23]。此外，在pH 較高時，肉眼能夠觀察到培養(yǎng)基的濁度降低，即生物量減少，微生物生長受到一定影響。燕傳明等[20,23]發(fā)現(xiàn)：從鎘污染土壤中分離出的菌株Bacillus cereusRC-1 的鎘積累主要依賴于胞外吸附，故細菌數(shù)量減少會降低鎘積累。

當pH為6時，V的去除率最高，達到63.33%，此時，依靠靜電吸引起到吸附效果；pH為7時，V的去除率最低，僅有34.15%，而隨著堿度上升，V的去除率再次升高，pH 為9 時，達到59.05%，雖然使質子化現(xiàn)象減弱，但細菌在生長過程中能夠把VO-3還原VO2+，培養(yǎng)基中的VO2+被帶負電的細菌吸附并離心，達到良好的去除效果。

培養(yǎng)24 h 后，V 和Cd 均能達到較高去除水平的最佳實驗條件為：釩初始質量濃度200 mg/L、鎘初始質量濃度5 mg/L、溫度30 ℃。而pH對2種重金屬去除率影響最大，拮抗趨勢明顯，在其他均為最佳條件下，pH為6時，V去除率達38.23%，pH為7時，Cd去除率達44.15%。

2.3 菌體的紅外吸收光譜分析

利用細胞壁及EPS對重金屬離子進行吸附是不依賴細胞代謝的過程，通過傅里葉轉換紅外光譜(FT-IR)能夠檢測出與重金屬離子結合的基團[29]。在菌株VCR02生長的培養(yǎng)基中加入重金屬Cd2+和VO-3前后的FT-IR 紅外光譜如圖8所示。從圖8可見，菌體與分泌的胞外多聚物所帶有的基團特征最適合的區(qū)域分布在1 000～1 700 cm-1之間。在加入重金屬前，主要特征峰在1 081.43，1 244.88，1 402.54，1 554.41，1 650.36，2 962.73和3 417.39 cm-1處，表明菌株VCR02 表面存在大量的磷酸二酯基團、酰胺基團(碳氮鍵、羰基)等；加入重金屬后，菌體表面的基團沒有發(fā)生變化，但是這些基團所對應的波譜有所偏移，特征峰值變?yōu)? 080.95，1 243.91，1 402.05，1 552.00，1 652.77，2 961.77 和3 414.49 cm-1，說明這些基團與重金屬的去除有關。

圖8 菌株VCR02培養(yǎng)加入重金屬前后紅外光譜圖Fig.8 Intra-IR spectra of bacterial strain VCR02 before and after adding heavy metals

細菌的細胞壁表面具有多種有機官能團如羥基、羧基、巰基、磷酸基團等，它們在與重金屬結合效率很高[8]。另一方面，微生物在生長過程中還會分泌大量胞外聚合物，其中包括多糖、蛋白質等[30]，它們同樣包含許多陰離子的官能團，能夠與水中的重金屬離子發(fā)生螯合作用使之去除。通過這2 種方式，微生物能夠阻止重金屬進入細胞，從而減輕毒害作用[31]。

在重金屬吸附前后，菌株所對應的特征峰并沒有出現(xiàn)消失以及新增的現(xiàn)象，說明在吸附過程中，重金屬原子并沒有使鍵發(fā)生破壞。在加入重金屬后，氨基(—NH2)所對應的吸收峰3 417.39 cm-1偏移最大，下降至3 414.49 cm-1。這表明在吸附過程中，氨基起到最為重要的作用，能夠吸附重金屬V和Cd。同時，磷酸二酯基團(PO2-)、酰胺基團(C—N，C—H，C=O)、烷基(C—H)所對應的吸收峰分別由1 244.88，1 554.41，1 650.36和2 962.73 cm-1偏移至1 243.91，1 552.00，1 652.77和2 961.77 cm-1，表明這部分基團在生物吸附過程中發(fā)揮了作用，其中酰胺基團偏移較多，故在吸附過程中表現(xiàn)更活躍。

一般認為，含氧基團中的氧原子由于外層電子層不飽和，易于從其他原子中奪取電子，從而使得氧帶負電荷，而帶正電的Cd2+則會與氧負離子結合，形成普通的化學鍵甚至形成穩(wěn)定的配位結構，從而實現(xiàn)對Cd2+的吸附。此外，能夠觀察到表中所示的含氮基團(酰胺基團、氨基)的吸收峰均有所變化，這可能是基團中的氮原子與重金屬離子發(fā)生配位作用而產生的[15]。燕傳明等[20]分別對活菌吸附、死菌吸附的菌體進行了FTIR 分析，發(fā)現(xiàn)磷酸基團只在死菌中參與對重金屬鉛鎘的吸附，所以在對菌株VCR02 進行檢測后，磷酸基團的吸收峰有所偏移，但偏移卻不大。

3 結論

1)4株菌均為革蘭氏陰性，甲基紅試驗、葡萄糖產酸試驗、蔗糖產酸試驗中菌株VCR01，VCR02，VCR04 呈陽性，菌株VCR03 呈陰性，4株菌均不能水解淀粉，也不具有高鹽度耐受性。菌株VCR01 和VCR02 對V 去除效果較好，菌株VCR02 和VCR04 對鎘去除效果較好，2 種重金屬總去除率從大到小順序為：VCR02，VCR04，VCR01，VCR03。

2)對釩鎘去除效果最優(yōu)菌株為VCR02，經16S rRNA 測序鑒定為芽孢桿菌；因吸附位點的原因，釩鎘2 種重金屬的去除效果多數(shù)呈拮抗趨勢，但在最優(yōu)實驗條件下此趨勢并不明顯，V 和Cd 均能達到較高去除水平的最佳實驗條件為：釩初始質量濃度200 mg/L、鎘初始質量濃度5 mg/L、溫度30 ℃；而在不同pH下，菌株表面基團質子化程度不同，直接影響V去除效果，pH為6時，V去除率最高達38.23%，pH 為7 時，Cd 去除率最高達44.15%。

3)加入重金屬未使菌體表面基團發(fā)生改變，在重金屬去除過程中，含氮基團氨基(—NH2)起到最重要作用的基團，能與重金屬離子發(fā)生配位反應；磷酸二酯基團(PO2-)、酰胺基團(C—N，C—H，C=O)等基團也因靜電吸附起到一定作用。