張幸子， 王曉惠， 王澤建， 陳必欽， 李 丹， 郭美錦， 儲 炬， 莊英萍

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家生化工程技術(shù)研究中心(上海)，上海 200237；2. 內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司，呼和浩特 010000）

輔酶Q10（Coenzyme Q10）是一種廣泛存在于生物體細(xì)胞膜上的脂溶性化合物，又稱為泛醌（Ubiquinone），它作為線粒體呼吸鏈上的電子載體，負(fù)責(zé)將電子從復(fù)合物I（或復(fù)合物II）傳遞至復(fù)合物III[1-3]。研究表明，輔酶Q10具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基以及促進(jìn)ATP （三磷酸腺苷）合成等生理功能[4-6]，它可以降低體內(nèi)氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)[7]，臨床上常與他汀類藥物聯(lián)用治療心血管疾病[8-9]，近二十年來其市場需求逐步增加，通過微生物法生產(chǎn)輔酶Q10市場潛力巨大[10]。

微生物雖然可以產(chǎn)生輔酶Q10，但對于自然界中的野生型菌株來說，其輔酶Q10的天然產(chǎn)量都較低，需要通過選育高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵工藝和提高分離純化效率等手段，最大限度地提高輔酶Q10的產(chǎn)量，才能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求[11-12]。類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）是近年來常用的輔酶Q10生產(chǎn)菌株，不少研究者從誘變育種、基因改造、代謝工程等角度出發(fā)來提高菌株產(chǎn)量[13-14]。扶教龍等[15]利用菌株對維生素K3、疊氮化鈉和對羥基苯甲酸的復(fù)合抗性作為篩選標(biāo)記，對類球紅細(xì)菌使用亞硝基胍進(jìn)行化學(xué)誘變，成功篩選出一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。Zhu等[16]通過表達(dá)類球紅細(xì)菌中光合作用基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ppsR和催化GGPP合成的crtE，增強(qiáng)了輔酶Q10生物合成中異戊二烯側(cè)鏈前體(GGPP)的供應(yīng)，使得改造菌RspPE的產(chǎn)量提高到73.2 mg/L，比野生菌提高了47%。

常溫常壓等離子體（Atmospheric and Room Tem–perature Plasma，ARTP）是由工作氣體在外加射頻電場的作用下，產(chǎn)生的溫度在25～40 ℃之間的等離子體射流，其中包含了大量的活性粒子（如電子、離子、激發(fā)態(tài)原子、分子等），可以在常壓下處理微生物，使DNA等遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[17]，ARTP常溫常壓的工作條件有效降低了非致畸致變性處理的損傷與致死效應(yīng)[18]。ARTP對活細(xì)胞DNA的損傷強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其他誘變源，在一定范圍內(nèi)，DNA損傷強(qiáng)度與誘變率正相關(guān)，因此ARTP誘變比傳統(tǒng)誘變手段更為高效，已成功用于100多種微生物的誘變育種[19-20]。對于誘變獲得的大量突變株，需要選擇合適、高效的篩選壓力進(jìn)行快速選育，大多誘變育種是采用前體、抗生素或結(jié)構(gòu)類似物作為選擇壓力篩選[21-23]。在類球紅細(xì)菌發(fā)酵過程中，供氧一直是影響菌體生長和產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素。高的氧消耗速率才能保證菌體的快速生長和產(chǎn)物合成速率的提升，但生產(chǎn)過程中動力能源的消耗過大會增加企業(yè)的生產(chǎn)成本；同時(shí)，菌體在一定的氧限制條件下才會快速進(jìn)入次級代謝并開始啟動大量合成輔酶Q10。Kien等[24]通過在發(fā)酵前期降低通氣，限制供氧水平，有效提高了輔酶Q10產(chǎn)量。在相對低供氧情況下，如何篩選到菌體的比生長速率、氧親和力和產(chǎn)物合成速率均較高的生產(chǎn)菌株是提升生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。

本文通過 ARTP 作用的方式獲得輔酶Q10的高產(chǎn)突變株，在建立的高通量培養(yǎng)平臺上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)菌體產(chǎn)物的合成特性，采用降低生長環(huán)境中氧供應(yīng)的方法，構(gòu)建氧限制模型，即通過在平板培養(yǎng)基中添加無水亞硫酸鈉，脅迫菌體在氧限制的平板上生長的策略，快速篩選出了輔酶Q10高產(chǎn)的突變株，并在5 L反應(yīng)器進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株及主要試劑 類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）J-1作為出發(fā)菌株，由內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司提供；輔酶Q10由浙江新和成有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 常壓室溫等離子體誘變儀(北京思清源生物技術(shù)公司，ARTP-II S型)；5 L反應(yīng)器（上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司）；高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies Inc, Agilent 1100 series)；尾氣質(zhì)譜儀(美國Extrel公司，MAX300-LG型)；葡萄糖測定儀（山東省科學(xué)院生物研究所，SBA-50B型）；可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司，721型）。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）平板培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物15，磷酸氫二鉀1，氯化鈉2，硫酸亞鐵0.1，硫酸鎂0.15，瓊脂粉20，輔液2 mL；pH 7.0～7.2。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）：硫酸銨3，酵母提取物8，谷氨酸鈉0.8，玉米漿干粉0.748，葡萄糖10，磷酸氫二鉀1.5，硫酸亞鐵0.25，硫酸鎂1.8，氯化鈉2，碳酸鈣8，輔液2 mL；pH 7.1～7.2。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：硫酸銨3，谷氨酸鈉3.5，玉米漿干粉4.2，磷酸二氫鉀1.6，硫酸亞鐵0.8，硫酸鎂10，氯化鈉3，氯化鈣0.07，葡萄糖32.5，碳酸鈣10（搖瓶培養(yǎng)），輔液2.5 mL；pH 6.5～6.6。

（4）輔液（g/L）：鹽酸硫胺1 ，生物素0.015 ，煙酸1[15]。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 平板培養(yǎng) 無菌條件下，從培養(yǎng)6～7 d的新鮮平板上挑取外觀飽滿、大小適中的菌落8～10個(gè)，放入裝有10 mL無菌生理鹽水的試管中，充分打散制成菌懸液，按照10倍梯度依次稀釋至母液的10?6倍，吸取0.1 mL菌液于平板均勻涂布后，放于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～7 d，培養(yǎng)過程中需避光。

1.2.2 種子培養(yǎng) 用無菌竹簽從新鮮培養(yǎng)的平板上挑取2～3個(gè)單菌落，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角搖瓶中，在32 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)28 h。當(dāng)種子液吸光度OD700達(dá)到6時(shí)，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 按16%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到500 mL三角搖瓶或5 L反應(yīng)器中。搖瓶培養(yǎng)基裝液量45 mL，添加碳酸鈣穩(wěn)定pH 值，在32 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩避光培養(yǎng)48 h。5 L反應(yīng)器培養(yǎng)基裝液量2 L，在32 ℃避光培養(yǎng)106 h，初始轉(zhuǎn)速400 r/min，發(fā)酵過程中用氨水控制pH 值為6.5～6.6，根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)堑南乃俾柿骷悠咸烟?，控制殘?zhí)琴|(zhì)量濃度不低于8 g/L。

1.2.4 孔板培養(yǎng)方法 無菌條件下，用10 μL移液槍從培養(yǎng)6～7 d的新鮮平板上挑取一個(gè)外觀飽滿、大小適中的菌落，直接打入24孔板中，加入培養(yǎng)基后蓋上蓋子，在32 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)20 h。按16%的接種量用8孔道移液器將種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中進(jìn)行發(fā)酵，在32 ℃、220 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩避光培養(yǎng)48 h。

1.3 ARTP誘變步驟

按1.2節(jié)中方法制備菌懸液，在無菌條件下吸取10 μL菌液涂于金屬載片上，使菌液均勻覆蓋在載片表面。用鑷子夾住載片放置在載物臺上相應(yīng)的孔位，把裝有990 μL無菌水的2 mL離心管卡入對應(yīng)的孔位下方。關(guān)閉艙門，設(shè)置好工作條件，進(jìn)行誘變。待照射結(jié)束后，金屬載片會自動落入下方的離心管中。將離心管置于旋渦振蕩器上劇烈振蕩1 min，使載片上的菌液洗脫完全，即得誘變后的菌懸液。

1.4 參數(shù)檢測

1.4.1 輔酶Q10含量檢測 由于利用類球紅細(xì)菌生產(chǎn)輔酶Q10基本上都是在胞內(nèi)的，所以檢測首先要將胞內(nèi)的輔酶Q10提?。ㄋ峄?、有機(jī)溶劑提取）后進(jìn)行檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取0.1 g輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，配制成1 g/L的標(biāo)品溶液，然后用無水乙醇將其稀釋至10、20、30、40、50 mg/L，再用0.22 μm有機(jī)相過濾頭過濾，供高效液相色譜儀分析。流動相為乙醇與甲醇（體積比1∶1）的混合液，色譜條件：檢測波長275 nm，流速1.1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃。色譜柱：Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

搖瓶反應(yīng)器中發(fā)酵液效價(jià)的檢測：發(fā)酵結(jié)束后，取5 mL發(fā)酵液置于50 mL容量瓶中，加6 mol/L鹽酸溶液1滴，輕微振搖，再加無水丙酮10 mL、9.8 mol/L雙氧水1 mL，用無水乙醇定容至刻度，超聲提取45 min。用0.22 μm濾頭過濾，吸取1 mL置于液相小瓶中供液相檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液效價(jià)。

孔板中發(fā)酵液效價(jià)的檢測：發(fā)酵結(jié)束后，用8孔道移液器吸取0.5 mL發(fā)酵液，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)與孔板相對應(yīng)的位置中，加6 mol/L鹽酸溶液50 μL，輕微振蕩搖孔板，加入無水丙酮1 mL、9.8 mol/L雙氧水100 μL，再加入3.35 mL無水乙醇，蓋上蓋子，超聲提取45 min。用0.22 μm濾頭過濾，吸取1 mL置于液相小瓶中供液相檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液效價(jià)。

1.4.2 菌濃檢測和菌體干重測定 通過比濁法測定發(fā)酵液中的菌體濃度：取發(fā)酵液 5 mL，稀釋至合適梯度振蕩均勻后，用分光光度計(jì)在700 nm波長處測OD700即得菌濃。

發(fā)酵70 h后，以干重表征菌濃：將定量濾紙置于105 ℃烘箱中烘2 h，取出準(zhǔn)確稱量濾紙質(zhì)量。取5 mL發(fā)酵液于濾紙上抽濾，將沉淀用去離子水清洗3次后，置于烘箱中烘至恒重得沉淀質(zhì)量，除以取樣體積即得菌體干重（g/L）。

1.4.3 發(fā)酵液殘?zhí)菣z測 將發(fā)酵液在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清用去離子水稀釋至合適梯度后，用葡萄糖測定儀檢測。

1.4.4 在線攝氧率OUR檢測 發(fā)酵過程中采用質(zhì)譜儀對尾氣進(jìn)行檢測，使用Biostar軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，在線計(jì)算得到攝氧率OUR如下[25]：

其中，F(xiàn)in為進(jìn)氣流量（mmol/L），V為發(fā)酵液體積（L），φinert,in， φO2,in， φO2,out和 φCO2,out分別表示進(jìn)氣中惰性氣體、氧氣和尾氣中氧氣、二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)，pin表示進(jìn)氣氣壓（Pa），Tin為溫度（℃），h為進(jìn)氣的相對濕度（%），所有上述變量除Tin、h外均為在線檢測獲得，Tin、h為離線測定所得。

2 結(jié)果與討論

2.1 24孔板高通量培養(yǎng)方法的確定

2.1.1 孔板供氧水平和發(fā)酵時(shí)間對輔酶Q10發(fā)酵的影響 輔酶Q10發(fā)酵過程是好氧發(fā)酵，使用24孔板培養(yǎng)時(shí)，不同的培養(yǎng)基裝液量會引起供氧水平的差異，從而影響產(chǎn)物合成。選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和3.5 mL的裝液量，以同一瓶種子瓶進(jìn)行接種，接種量16%、發(fā)酵48 h，考察孔板供氧水平對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響。由圖1可以看出，隨著裝液體積的提高，菌濃不斷增加?？装灏l(fā)酵過程中蒸發(fā)量大，裝液量越低蒸發(fā)越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致發(fā)酵液黏度上升，因此不利于菌體生長。當(dāng)裝液量為3.5 mL時(shí)，培養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，菌體生長情況最好，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的OD700可達(dá)22.9。但隨著裝液量的提高，氧傳遞系數(shù)KLa逐漸減小[26]，影響培養(yǎng)過程中的氣液傳質(zhì)效果，且每個(gè)孔板的裝液比變高使得空氣含量減少，會進(jìn)一步降低供氧水平，所以效價(jià)則呈現(xiàn)不同的變化趨勢，裝液量較高時(shí)，發(fā)酵結(jié)束的效價(jià)單位卻比較低。綜合考慮，選擇2.0 mL的孔板裝液量作為后續(xù)誘變初篩的培養(yǎng)體積。

圖1 不同裝液量對類球紅細(xì)菌菌濃和效價(jià)的影響Fig. 1 Effect of different loading volume on R. sphaeroides growth and titer

2.1.2 孔板培養(yǎng)平行性分析 確定裝液量后，對孔板培養(yǎng)平行性進(jìn)行評價(jià)（表1和表2）。結(jié)果表明24孔板發(fā)酵培養(yǎng)類球紅細(xì)菌時(shí)，同一孔板各行列效價(jià)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）最大為5.70%，平均為4.01%，不同孔板間效價(jià)的RSD最大為6.27%，平均為5.11%。該結(jié)果表明孔板培養(yǎng)的平行性良好，各行列之間的誤差較小，將24孔板用于誘變菌株的初篩引起培養(yǎng)誤差較小。

2.1.3 孔板培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)一致性考察 24孔板培養(yǎng)中每一個(gè)孔板的體積小，供氧水平、剪切程度和營養(yǎng)傳遞等與搖瓶存在差異，取同一種子液，采用孔板和搖瓶同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，比較了菌濃、效價(jià)、pH和殘?zhí)菍烧甙l(fā)酵結(jié)果的影響，分析了孔板微量培養(yǎng)代替搖瓶培養(yǎng)的可行性，培養(yǎng)結(jié)果如表3所示。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本被消耗完全，所以兩種培養(yǎng)模式下的pH 值和殘?zhí)菨舛认嘟??？傮w結(jié)果顯示孔板培養(yǎng)的菌濃和輔酶Q10含量略低于搖瓶培養(yǎng)，推斷與孔板培養(yǎng)的透氣膜孔小，蒸發(fā)量相對較大有關(guān)。但單位菌體的產(chǎn)率（Yp/x）非常一致，誤差低于2%，說明孔板培養(yǎng)條件下，菌體的合成代謝能夠反映搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果，尤其是在初篩菌株時(shí)是完全可以用孔板替代搖瓶進(jìn)行高通量篩選的。

表1 同一塊孔板各行列平均效價(jià)差異Table 1 Difference of titer between rows and columns in one plate

表2 不同孔板平均效價(jià)差異Table 2 Difference of titer in different plates

表3 24孔板和搖瓶發(fā)酵情況對比Table 3 Comparison of fermentation conditions in 24-well plate and shake flask culture

為進(jìn)一步考察孔板培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)的一致性，延長發(fā)酵時(shí)間，選取2.0、2.5、3.0、3.5 mL的孔板培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)（50 mL）對比，分析48 h和60 h培養(yǎng)周期下產(chǎn)物合成的差異，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長至60 h時(shí)，培養(yǎng)基中的碳源基本被消耗完全，營養(yǎng)限制使得菌體發(fā)生裂解，導(dǎo)致不同發(fā)酵體積的菌濃均有所下降。圖2(b)結(jié)果表明在糖耗盡時(shí)，還有一些積累的中間代謝物參與了產(chǎn)物的合成，所以60 h時(shí)孔板和搖瓶的效價(jià)都呈現(xiàn)增長趨勢，且孔板和搖瓶中效價(jià)的增長幅度相似（R2=0.902 6），表明孔板能夠反映常規(guī)搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以孔板培養(yǎng)替代搖瓶培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)高通量菌株發(fā)酵性能篩選的方法是可行的。

2.2 高產(chǎn)菌株的誘變篩選

2.2.1 ARTP致死率曲線 ARTP誘變儀采用純度99.99%以上的高純度氦氣作為工作氣體，工作時(shí)可變參數(shù)有3個(gè)：功率、載氣量和時(shí)間，一般來說儀器的功率是固定的，主要改變載氣量和工作時(shí)間。為了尋找最佳的菌體誘變條件，在10 L/min的載氣量下，設(shè)定不同的工作時(shí)間（0、10、15、20、25、30、35 s和40 s）進(jìn)行誘變處理。將不同處理時(shí)間得到的菌液進(jìn)行梯度稀釋（一般稀釋至10?4倍），取100 μL涂布于固體平板上，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，32 ℃避光培養(yǎng)6～7 d，根據(jù)平板上的菌落數(shù)目繪制致死率曲線（見圖3）。隨著誘變時(shí)間的增加，致死率不斷上升，當(dāng)誘變時(shí)間為30 s時(shí)，致死率能夠達(dá)到99.04%，而其他微生物如白色鏈霉菌誘變420 s時(shí)的致死率為94.4%[27]，可見類球紅細(xì)菌對等離子體的致死作用較為敏感。一般情況下，致死率越高菌株越容易發(fā)生突變，致死率在80%～90%時(shí)較為合適，因此為了獲得更多的突變株，本實(shí)驗(yàn)選擇25 s作為最佳誘變時(shí)間，此時(shí)的致死率為86.02%。

圖2 類球紅細(xì)菌發(fā)酵48 h和60 h菌濃和效價(jià)的對比Fig. 2 Comparison of R. sphaeroides growth and titer between 48 h and 60 h fermentation

圖3 類球紅細(xì)菌的ARTP致死率曲線Fig. 3 Lethality curve of R. sphaeroides treated by ARTP

2.2.2 氧限制模型的構(gòu)建 供氧受限能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)輔酶Q10的積累。無水亞硫酸鈉還原性極強(qiáng)，易溶于水，可與水中的氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)，降低培養(yǎng)環(huán)境空間的氧濃度。通過在平板培養(yǎng)基中添加無水亞硫酸鈉構(gòu)建氧限制模型，可以篩選出在氧限制條件下能夠正常生長和合成產(chǎn)物的菌株。將出發(fā)菌株的菌懸液涂布于含有不同質(zhì)量濃度無水亞硫酸鈉的平板上，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，32 ℃避光培養(yǎng)6～7 d，統(tǒng)計(jì)各質(zhì)量濃度平板上的菌落個(gè)數(shù)。從表4中可以看出，平板中無水亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 g/L時(shí)，已無菌落長出。比較菌株在原始平板和添加0.2 g/L無水亞硫酸鈉的平板上的菌落形態(tài)（圖4）可以看出，原始平板上長出的菌落直徑較大，且前期采用原始平板傳代時(shí)，菌株會發(fā)生退化導(dǎo)致菌落變?yōu)辄S色，退化菌落發(fā)酵后輔酶Q10的產(chǎn)量很低，而氧限制平板上長出的菌落顏色變?yōu)楦畹哪G色，直徑較小且邊緣整齊清晰，黃色菌落出現(xiàn)的概率大大減小。推測在該模型下長出的菌落有較強(qiáng)的氧親和力，胞內(nèi)呼吸代謝旺盛因而能夠耐受低氧環(huán)境，具備輔酶Q10高產(chǎn)的潛力。因此為了提高篩選效率，將突變株在含有0.4 g/L無水亞硫酸鈉的氧限制模型下生長。

表4 不同質(zhì)量濃度的無水亞硫酸鈉對菌落生長情況的影響Table 4 Effects of different mass concentrations of sodium sulfite on R. sphaeroides colony forming units (CFU)

圖4 正常平板（a）與0.2 g/L無水亞硫酸鈉的平板上（b）培養(yǎng)菌落形態(tài)對比Fig. 4 Morphological comparison of colonies on normal plate (a)and 0.2 g/L sodium sulfite plate (b)

2.2.3 ARTP誘變結(jié)合氧限制模型篩選高產(chǎn)菌株 將用ARTP誘變25 s的類球紅細(xì)菌菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布到無水亞硫酸鈉質(zhì)量濃度為0.4 g/L的平板上，培養(yǎng)6～7 d，在平板上可以生長的即為在氧限制環(huán)境下呼吸能力較強(qiáng)的突變菌株，從中挑選顏色鮮艷、外觀飽滿的單菌落，進(jìn)行孔板初篩，培養(yǎng)體積2 mL，發(fā)酵48 h，產(chǎn)物采用HPLC檢測。共篩選了506株菌，結(jié)果如圖5所示。

2.2.4 高產(chǎn)菌株搖瓶復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證 選取孔板初篩效價(jià)提高25%以上的6株突變株，分別為R. sphaeroidesF3C21、R. sphaeroidesF4B01、R. sphaeroidesF4E15、R. sphaeroidesF5D13、R. sphaeroides

圖5 突變株24孔板初篩結(jié)果Fig. 5 Preliminary screening results of mutants by 24-well plates

F6F19和R. sphaeroidesF6G16，連續(xù)傳代培養(yǎng)并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，驗(yàn)證高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，隨著傳代的進(jìn)行，突變株的效價(jià)略有下降，其中R. sphaeroidesF3C21退化較大，R.sphaeroidesF5D13、R. sphaeroidesF4B01和R.sphaeroidesF6G16的遺傳穩(wěn)定性較好，R. sphaeroidesF5D13傳代5代后的效價(jià)最高，為111.8 mg/L，比出發(fā)菌株（86.2 mg/L）提高了29.7%。

圖6 菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證Fig. 6 Verification of genetic stability of the strain

2.2.5 高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株的生理代謝特性參數(shù)比較 為了進(jìn)一步評估高產(chǎn)菌株R. sphaeroidesF5D13的生產(chǎn)能力，本文在5 L反應(yīng)器中開展了高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，并對過程中的參數(shù)進(jìn)行采集，進(jìn)一步分析高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株在菌體生長和產(chǎn)物合成之間的差異，結(jié)果如圖7和表5所示。在菌體生長方面，發(fā)酵前期（0～36 h），菌體快速生長，菌濃不斷提高，32 h時(shí)高產(chǎn)菌株R. sphaeroidesF5D13菌濃比出發(fā)菌株R. sphaeroidesJ-1菌濃明顯高14.5%，R.sphaeroidesF5D13的最大比生長速率為0.092 2 h?1，比R. sphaeroidesJ-1高了6.84%，表明在進(jìn)入產(chǎn)物合成期前（48 h），R. sphaeroidesF5D13累積了較高的生物量進(jìn)行產(chǎn)物合成。比較發(fā)酵中后期（48～100 h）兩者的效價(jià)增長趨勢（圖7b），R. sphaeroidesF5D13的初始效價(jià)明顯高于R. sphaeroidesJ-1，后期兩者的差異越來越大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)高產(chǎn)菌株的效價(jià)為770.06 mg/L，較出發(fā)菌株的652.69 mg/L提高了18.0%，糖轉(zhuǎn)化率也較高。觀察發(fā)酵過程的攝氧率OUR曲線（圖7c）可以看出，前期R. sphaeroidesF5D13的OUR較早進(jìn)入爬升期，隨后下降進(jìn)入穩(wěn)定期，最終維持在80左右；而R. sphaeroidesJ-1穩(wěn)定期的OUR維持在60左右，明顯低于R. sphaeroidesF5D13。推測是前期高產(chǎn)菌R. sphaeroidesF5D13活力高、耗氧快，促進(jìn)菌濃增加，OUR較早進(jìn)入高點(diǎn)開始合成產(chǎn)物，因而初期的起步效價(jià)也較高；當(dāng)產(chǎn)物大量合成，即OUR進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，高產(chǎn)菌株對氧親和力強(qiáng)，呼吸代謝較出發(fā)菌株更為旺盛，更有利于維持產(chǎn)物的合成，氧消耗速率OUR也穩(wěn)定在較高水平。結(jié)合比耗氧速率QO2變化（圖7d），高產(chǎn)菌株的QO2一直高于出發(fā)菌株，尤其是在產(chǎn)物合成的發(fā)酵中后期，進(jìn)一步表明次級代謝階段高產(chǎn)菌株細(xì)胞活力優(yōu)于出發(fā)菌株，產(chǎn)物合成能力較強(qiáng)。

圖7 5 L反應(yīng)器中出發(fā)菌株和高產(chǎn)菌株發(fā)酵過程變化的差異Fig. 7 Difference of fermentation process between the high-yield strain and the parent strain in 5 L fermentation reactor

表5 出發(fā)菌株和高產(chǎn)菌株R. sphaeroides F5D13發(fā)酵過程參數(shù)Table 5 Calculated parameters of the fermentation conditions by R. sphaeroides J-1 and R. sphaeroides F5D13

3 結(jié)束語

為提高突變菌株的篩選效率，簡化培養(yǎng)過程，本文以孔板代替搖瓶進(jìn)行突變株的初篩，探究了不同供氧水平對菌體細(xì)胞代謝特性的影響，對孔板中不同體積的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果顯示裝液量為2.0 mL、發(fā)酵周期為48 h時(shí)，孔板的菌濃和效價(jià)都和搖瓶結(jié)果相近，不同孔板位置培養(yǎng)的差異在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，因此孔板可以用于類球紅細(xì)菌突變菌株的高通量培養(yǎng)。

ARTP作為一種新興的誘變手段，相較于傳統(tǒng)誘變技術(shù)更為高效，釋放的等離子體射流中包含的活性粒子可以引起細(xì)胞DNA的斷裂，進(jìn)一步引發(fā)DNA易錯性修復(fù)機(jī)制，從而可以在短時(shí)間內(nèi)處理生物細(xì)胞產(chǎn)生大量的突變體，提高突變率[28]。本文將ARTP技術(shù)應(yīng)用于類球紅細(xì)菌的誘變，并針對產(chǎn)物合成特性，首次采用無水亞硫酸鈉構(gòu)建氧限制模型篩選突變株。篩選得到高產(chǎn)菌株R. sphaeroidesF5D13，其傳代5次以后的搖瓶效價(jià)為111.8 mg/L，比出發(fā)菌株的86.2 mg/L提高了29.7%，遺傳穩(wěn)定性良好。在5 L反應(yīng)器中的培養(yǎng)結(jié)果顯示，高產(chǎn)菌株R. sphaeroidesF5D13發(fā)酵前期生長快，發(fā)酵中后期則表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧親和力，耗氧速率明顯維持在一個(gè)較高水平，最終輔酶Q10的效價(jià)較出發(fā)菌株提高了18.0%，達(dá)到了770.06 mg/L。

綜上所述，利用ARTP對類球紅細(xì)菌進(jìn)行誘變，結(jié)合氧限制模型進(jìn)行篩選，可以有效篩選出輔酶Q10的高產(chǎn)菌株。后續(xù)可針對篩選得到的高產(chǎn)菌株，從供氧、補(bǔ)料等方面進(jìn)行發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，以期取得產(chǎn)能的再提升。