汪艷，金瓊，陳威，黃慧

1.溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 種植科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，浙江 溫州 325027；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 修復科，上海 200011

微小RNA（microRNA，miRNA）是小的內(nèi)源性RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達[1]。本課題組在前期對成骨調(diào)控的研究過程中發(fā)現(xiàn)miRNA參與釉基質(zhì)蛋白誘導小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1細胞成骨分化過程，挑選出了一系列發(fā)生顯著表達異常的miRNAs。其中miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c和miR-30d在成骨分化過程中顯著下調(diào)，同時這些家族成員的抑制劑則可以促進成骨分化[2]。有學者發(fā)現(xiàn)miR-30家族成員可恢復骨吸收與骨生成間的平衡[3]。由于miRNA動物實驗的體內(nèi)環(huán)境復雜、實驗周期較長，對miRNA產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求，本研究將采用穩(wěn)定性更好、可靠性更高的化學修飾miRNA antagomir進行體外實驗，在細胞水平進行miR-30d拮抗劑（antagomir-30d）及其陰性對照（NC）的轉(zhuǎn)染實驗，驗證antagomir-30d在細胞水平對成骨分化的調(diào)控作用，并通過轉(zhuǎn)染不同濃度后成骨基因表達水平確定其最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1 材料和方法

1.1 材料 4周齡SPF級Wistar雄性大鼠由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供。α-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，DME培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，SYBR?PrimeScript?RTPCR Kit購自日本Takara公司，RNAse Free Water購自美國Ambion公司，引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，cDNA合成試劑購自日本Takara公司，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的獲取和培養(yǎng)方法：大鼠脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，無菌條件下取其脛骨和股骨，剔除周圍附著肌肉，將其兩端干骺端剪除，顯露骨髓腔。10 mL無菌注射器吸取含有肝素（200 U/mL）和10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔至由紅色變白色。細胞懸液以1 800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，并加入標準培養(yǎng)液10 mL，用滴管輕輕吹散細胞團后接種于10 cm培養(yǎng)皿。放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日首次換液后每3 d換一次液。待鏡下觀察細胞增殖至80%時，吸棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶和0.02%EDTA消化培養(yǎng)皿底貼壁細胞，約1～2 min至鏡下見貼壁細胞皺縮后，加入適量培養(yǎng)液終止消化，吸取培養(yǎng)液輕吹尚未脫落的細胞至所有細胞懸起，然后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，吹打使之分散均勻。用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞數(shù)量。將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入α-MEM培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，輕輕吹打使細胞分散均勻，接種于數(shù)個10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)變化。待細胞增殖至80%時按上述操作進行傳代。采用第2或3代細胞進行后續(xù)實驗。細胞行成骨誘導分化時，需采用成骨誘導培養(yǎng)液。

1.2.2 待轉(zhuǎn)染試劑準備方法：Antagomir-30d是經(jīng)過特殊化學修飾的miR-30d的拮抗劑，適用于細胞實驗、動物實驗。NC采用無意義的一段核苷酸，用于antagomir-30d的陰性對照；antagomir-30d、NC以及用于檢測轉(zhuǎn)染效率經(jīng)Cy3熒光標記的NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成提供，由于經(jīng)過特殊化學修飾，使用時無需轉(zhuǎn)染試劑即可跨越細胞膜進入細胞內(nèi)。產(chǎn)品以凍干粉的形式，常溫運輸，并于-80～-20 ℃保存。使用前需將其配置為20 μmol/L的儲備液，操作步驟：低速條件下離心儲存管，讓凍干粉聚集在試管的底部。輕輕打開管蓋，加入DEPC水若干，配成20 μmol/L的儲備液，柔和地用移液槍吹打儲備液5次。根據(jù)具體用量分裝，避免多次凍融，重新貯存時注意密封好EP管，-80 ℃貯存?zhèn)溆?。為避免外界因素（包括酶、極端pH或溫度條件等）導致產(chǎn)品降解，所有操作均嚴格遵循RNA操作規(guī)則。實驗過程中試劑于冰上放置。

1.2.3 細胞處理方法：采用第2或3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔的細胞密度為5×104個/mL。分為3組：不同濃度的antagomir-30d（antagomir-30d組）、陰性對照（NC組）和未做轉(zhuǎn)染的BMSCs（空白組），每組3個復孔。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC，終濃度依次為50、100、150、200 nmol/L，空白組不做處理。48 h后更換成骨誘導液，每3 d換一次液，培養(yǎng)至7 d，收集細胞。選用不同濃度的antagomir-30d及其NC進行BMSCs的轉(zhuǎn)染，通過RT-PCR技術(shù)測定成骨基因ALP、骨鈣素（osteocalcin，OC）和Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的mRNA表達量，以確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.4 RT-PCR方法：TRIzol法抽提細胞總RNA。依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫查詢大鼠相關基因的mRNA序列，應用Oligo 6.71軟件進行引物設計。實驗內(nèi)參基因選用GAPDH基因，引物序列為網(wǎng)站上已報道的序列。引物由上海生工生物工程公司（http：//www.sangon.com/）合成，保存濃度為100 pmol/μL，工作濃度為10 pmol/μL。將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應體系，加樣。表達量的計算采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1 RT-PCR使用的引物序列

1.2.5 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染方法：采用第2或第3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，每孔的細胞密度為5×104個/mL，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到30%～50%（推薦轉(zhuǎn)染密度），另設2個復孔。鋪板次日，將Cy3熒光（紅色熒光染料）標記的NC加入六孔板中，使其濃度達到最佳轉(zhuǎn)染濃度。48 h后取出六孔板，去原液，用PBS洗滌3遍后置熒光顯微鏡下（Olympus IX71）觀察，顯微參數(shù)為550 nmol/L激發(fā)波長，570 nmol/L發(fā)射波長。100倍視野下兩人同時獨立計數(shù)相同視野下紅色熒光數(shù)，每孔共計5個高倍鏡視野。每孔轉(zhuǎn)染效率（%）=紅色熒光數(shù)/總細胞數(shù)×100%。每孔5個高倍鏡視野取平均值，最終每組3孔平均值確定為轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 ALP染色方法：采用第2或3代BMSCs鋪板于六孔板底，每孔的細胞密度為5×104個/mL。共分3組：空白組、antagomir-30d組、NC組。鋪板后次日antagomir-30d組與NC組分別加入antagomir-30d與NC，終濃度為RT-PCR檢測的最佳濃度，空白組不做處理。48 h后更換成骨誘導液，每3 d換一次液，培養(yǎng)至7 d，行ALP染色，檢測ALP活性。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下細胞形態(tài)觀察 全骨髓接種5 d后貼壁細胞主要為BMSCs，貼壁細胞形成大小不等分散的細胞集落，形態(tài)多呈梭形，見圖1A。7 d后細胞集落數(shù)量明顯增加，且集落內(nèi)細胞呈漩渦狀排列，集落明顯增大，并呈放射狀向周圍擴張，細胞集落間相互融合成為單層，見圖1B。待細胞融合度達80%即可消化傳代。

圖1 原代大鼠BMSCs的形態(tài)（×100）

2.2 不同濃度各組細胞成骨基因表達 成骨誘導7 d后，antagomir-30d組、NC組和空白組均可檢測到成骨相關基因的表達，見圖2。各濃度NC組與相同濃度空白組成骨基因ALP、OC及RUNX2的mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。當轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L，antagomir-30d組ALP、OC和RUNX2的mRNA表達量與NC組和空白組比均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 細胞最佳轉(zhuǎn)染濃度確定 選用0、50、100、150、200 nmol/L濃度的antagomir-30d對BMSCs進行轉(zhuǎn)染并經(jīng)成骨誘導。150 nmol/L濃度的antagomir-30d ALP的mRNA表達量與0 nmol/L比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各濃度的antagomir-30d OC和RUNX2 mRNA表達量與0 nmol/L比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；當antagomir-30d濃度為150 nmol/L時成骨效果最佳，見圖3。

2.4 BMSCs轉(zhuǎn)染效率觀察 Cy3熒光標記的NC以最佳濃度150 nmol/L轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h后，光鏡見BMSCs形成一層貼壁細胞，增殖至約70%，漂浮死細胞較少；熒光顯微鏡觀察示BMSCs細胞轉(zhuǎn)染效率可達68.75%±8.54%，見圖4。

2.5 各組ALP染色結(jié)果 150 nmol/L antagomir-30d組、NC組和空白組7 d后BMSCs ALP染色均呈紫色（＋）；空白組與NC組染色程度接近，均淺于antagomir-30d組，見圖5。

圖2 不同濃度各組BMSCs成骨誘導7 d后成骨基因mRNA表達水平比較

圖3 各濃度antagomir-30d各成骨基因mRNA表達水平比較

圖4 BMSCs轉(zhuǎn)染效率觀察

圖5 各組ALP染色結(jié)果比較

3 討論

研究表明miR-30a和miR-30d在人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（human bone morphogenetic protein 2，BMP-2）誘導C2C12間質(zhì)干細胞成骨分化過程中發(fā)生下調(diào)[4]。本課題組前期實驗在對成骨調(diào)控的研究過程中發(fā)現(xiàn)miRNA參與釉基質(zhì)蛋白誘導小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的成骨分化過程，并挑選出一系列發(fā)生顯著表達的miRNAs，其中miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c和miR-30d在釉基質(zhì)蛋白誘導的MC3T3-E1成骨分化過程中顯著下調(diào)。進一步實驗表明Smad1和RUNX2是miR-30家族的靶基因，當Smad1和RUNX2過表達時會顯著減少miR-30家族對成骨分化的抑制作用[2]。因此miR-30家族是成骨分化關鍵的負性調(diào)控因子，并通過負調(diào)控Smad1和RUNX2的表達而發(fā)揮成骨抑制作用。本研究挑選miR-30d作為調(diào)節(jié)因子，選用穩(wěn)定性更好、可靠性更高的化學修飾的miR-30d拮抗劑antagomir-30d及其無意義對照鏈NC進行實驗。

BMSCs作為成骨細胞的主要來源，是骨髓腔中的主要細胞，它是一種具有自我更新能力及多重分化能力的干細胞，在特定條件下可以向骨、軟骨、脂肪等多種組織細胞分化[5]。BMSCs在礦化誘導的培養(yǎng)條件下，可以向成骨細胞分化，并表現(xiàn)出較高的ALP活性，可分泌OC和I型膠原等細胞外基質(zhì)。BMSCs可在骨重建和損傷再生中發(fā)揮重要的作用[6]。另外，BMSCs體外增殖能力強，取材容易，免疫原性低，并且能夠趨化成骨前體細胞至骨缺損部位誘導激活植入體處早期骨形成的通路，目前被認為是促進體內(nèi)成骨的優(yōu)良種子細胞源。

BMSCs的成骨分化能力與其合成分泌的酶以及細胞外基質(zhì)蛋白關系密切。ALP是細胞發(fā)生分化時所分泌產(chǎn)生的酶，成骨細胞從其前體細胞開始即表達ALP，在成熟的成骨細胞中ALP表達增加，但在成熟的骨細胞中ALP活性逐漸消失。因此，ALP活性被認為是反映成骨細胞成熟狀態(tài)的一個重要指標，又被認為是成骨的早期指標。ALP表達活性越高說明BMSCs向成骨細胞的分化越明顯[7]。OC是含量最豐富的骨非膠原蛋白，由成熟的成骨細胞合成。OC主要出現(xiàn)在礦化形成期，是反映成骨細胞成熟的標志，而且能準確代表成骨細胞的活性和骨轉(zhuǎn)換。RUNX2是調(diào)節(jié)成骨分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)ALP、OC等多種下游成骨基因的表達，RUNX2的表達反映新骨的形成[8]。

MiRNA產(chǎn)品的最佳工作濃度因細胞類型及研究目的不同而異?？筛鶕?jù)實驗具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染濃度，建議10～200 nmol/L。在研究miR-196b的表達與白血病的發(fā)展關系的實驗中，研究人員采用100 nmol/L濃度的antagomir-196b進行野生型C57BL6小鼠的骨髓基質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)染[9]。為了明確antagomir-30d及其NC轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染濃度，本研究共采用轉(zhuǎn)染因子的5個濃度梯度0、50、100、150、200 nmol/L進行比較，并檢測各成骨基因ALP、OC、RUNX2 mRNA的相對表達量。

由于轉(zhuǎn)染時所接種的細胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的關鍵因素之一，因此細胞接種密度過高和生長過度會削弱細胞活力，降低細胞的轉(zhuǎn)染效率。有學者研究發(fā)現(xiàn)在將anti-miR-21（miR-21的反義鏈）運用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至人HXO-RB44細胞48 h后，流式細胞儀顯示其轉(zhuǎn)染效率可達約69.85%[10]。國內(nèi)有學者構(gòu)建了大鼠microRNA-327重組腺病毒載體并轉(zhuǎn)染至心肌細胞，48 h后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示腺病毒轉(zhuǎn)染效率為90.15%±5.15%，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率為85.46%±3.08%[11]。銳博公司推薦轉(zhuǎn)染時應使接種細胞密度能夠達到30%～50%。熒光標記的miRNA產(chǎn)品可采用激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光顯微鏡等觀察到，可直觀地評估m(xù)iRNA產(chǎn)品的轉(zhuǎn)染效率。本研究結(jié)果顯示，當轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L時，轉(zhuǎn)染48 h后通過熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率可達68.75%±8.54%。

Antagomir-30d通過轉(zhuǎn)染BMSCs后可以促進其成骨分化，與空白及NC組比，相關成骨基因ALP、OC、RUNX2 mRNA表達上調(diào)，ALP染色活性增加；當轉(zhuǎn)染濃度為150 nmol/L時，antagomir-30d促進成骨分化的效果最好，各成骨基因的表達量上調(diào)最明顯。