李震岳，翁約約，，黃羅儀，王朝杰

1.溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院 溫州市中心醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

2020年WHO發(fā)布報(bào)告[1]稱，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約996萬，新增150萬耐藥性結(jié)核病患者，包括單藥耐藥結(jié)核?。╩onodrug-resistant TB，MR-TB）、多耐藥結(jié)核?。╬olydrug-resistant TB，PR-TB）、耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant TB，MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drugresistant TB，XDR-TB）等[2]。臨床常用抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素等，備選藥物有左氧氟沙星、莫西沙星和阿米卡星等[3]，但MDR-TB的全球平均治愈率僅維持在55%左右[4]。

隨著耐藥結(jié)核病患者的增多，研究和開發(fā)新的抗結(jié)核藥物已成為全球消除結(jié)核病的重要戰(zhàn)略組成部分。ZHAO等[5]報(bào)道了基于噁唑烷酮結(jié)構(gòu)合成的17類86種化合物，通過系列體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)象限制性的19c比目前臨床用于治療MDR-TB藥物利奈唑胺（Linezolid，Lin）[6]，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的舒特唑胺（Sutezolid，Sut）[7]、德帕唑胺（Delpazolid，Del）[8]和TBI-223（223）[9]安全性和療效更佳。本研究將對上述五種化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行計(jì)算分析，探索內(nèi)在關(guān)系，促進(jìn)MDR-TB新藥研發(fā)。五種化合物的2D結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 五種化合物的2D結(jié)構(gòu)式

1 計(jì)算方法

藥物分子構(gòu)象采用MMFF94力場進(jìn)行分子力學(xué)計(jì)算，在GaussView6.0中的附加模塊GMMX中實(shí)現(xiàn)。使用默認(rèn)參數(shù)集，總能隙為3.5 kcal·mol-1。當(dāng)超過10 000次試驗(yàn)的限制，或經(jīng)過50次連續(xù)試驗(yàn)，仍沒有新的構(gòu)象位于能量間隙內(nèi)全局最低限度，則停止搜索。

理論計(jì)算采用密度泛函理論的M06-2X方法，在6-311+G（2d，p）基組水平上對圖1五種化合物在真空環(huán)境幾何結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，再進(jìn)行紅外（IR）振動光譜、紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜、電子圓二色（ECD）譜計(jì)算。已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道顯示，M06-2X這種雙雜化元廣義梯度近似方法（DH m-GGA）在預(yù)測分子幾何形狀、拉曼強(qiáng)度、熱化學(xué)和動力學(xué)、非共價(jià)相互作用等方面表現(xiàn)良好。在上述優(yōu)化結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自洽反應(yīng)場方法中的極化連續(xù)介質(zhì)模型模擬環(huán)己烷（cyclohexane，Cyc）、水（water，Wat）和甲醇（methanol，Met）溶劑環(huán)境，再用同一基組水平的含時(shí)密度泛函理論進(jìn)行UV-Vis吸收光譜和ECD譜計(jì)算，所得波函數(shù)用于電子結(jié)構(gòu)分析和概念密度泛函理論系列指數(shù)分析，包括分子的親電/親核性預(yù)測，整體反應(yīng)性描述符包括電離勢（IP）、電子親和勢（EA）、電負(fù)性（χ）、整體硬度（η）、化學(xué)勢（μ）、整體親電指數(shù)（ω）和整體柔軟度（S）等計(jì)算參照文獻(xiàn)[11-13]中定義公式。藥代動力學(xué)計(jì)算借助ACD/Labs Percepta平臺實(shí)現(xiàn)，該平臺基于QSAR（quantitative structure-activity relationship）模型預(yù)測化合物的藥代動力學(xué)部分參數(shù)和理化性質(zhì)。所有量化計(jì)算和分析使用Guassian 16程序和Multiwfn 3.8[14]軟件完成。

2 結(jié)果和討論

2.1 構(gòu)象分析 由圖1可見，在19c分子中僅有4根鍵可以旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生構(gòu)象，加上環(huán)構(gòu)象變化，而Sut有5根鍵可以旋轉(zhuǎn)，Del中4根鍵，233中6根鍵，Lin中5根鍵，各自環(huán)的構(gòu)象變化有差異。運(yùn)用MMFF94力場搜索顯示，在相同的能量范圍內(nèi)，19c僅有21種構(gòu)象異構(gòu)體，Sut有48種，Del有63種，223有69種，Lin有56種，可見19c在3aS位實(shí)現(xiàn)關(guān)環(huán)，從而大大減少藥效構(gòu)象，在文獻(xiàn)[5]的系列實(shí)驗(yàn)中也體現(xiàn)其構(gòu)象限制帶來安全性和療效的提升。

2.2 幾何結(jié)構(gòu) Lin為噁唑烷酮類抗革蘭氏陽性菌藥物，同時(shí)對MDR-TB具有良好的抗菌活性，本研究的其他四種最典型化合物均以其為基礎(chǔ)發(fā)展而來。圖2繪制了采用M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的該五種化合物在真空、環(huán)己烷和水環(huán)境中的幾何結(jié)構(gòu)，主要鍵長依次標(biāo)注在相應(yīng)位置。五種化合物均有3a，4-dihydro-1H，3H-benzo[b]oxazolo[3，4-d][1，4]oxazin-1-one的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)核，是抗菌活性的中心。ZHAO等[5]發(fā)現(xiàn)（3S，3aS）構(gòu)型是抗結(jié)核活性的最佳構(gòu)型，即（3S，3aS）-3a，4-dihydro-1H，3H-benzo[b]oxazolo[3，4-d][1，4]-oxazin-1-one核，關(guān)鍵是苯基環(huán)上的R1基團(tuán)和噁唑烷酮環(huán)上的R2基團(tuán)的變化。在R1位引入嗎啉環(huán)等基團(tuán)，在R2位取代為氨基、雜環(huán)等先后獲得86種化合物，19c（見圖2）被確定為治療MDR-/XDR-TB的一種很有潛力的分子。

三種環(huán)境計(jì)算19c結(jié)構(gòu)中，C=O隨著極性增加而逐漸伸長，增加約0.01?，其余鍵長變化甚微，飽和硫嗎啉環(huán)鍵長變化僅有～0.003?。其他結(jié)構(gòu)中C=O鍵長變化與19c類似。Sut是Lin的硫代類似物，其中嗎啉基氧被硫取代。MICHALSKA等[15-16]對Sut在環(huán)糊精改性非水毛細(xì)管電泳的對映選擇性識別研究中，采用B3LYP/6-31G*進(jìn)行了中性態(tài)和質(zhì)子化態(tài)的計(jì)算，并通過IR光譜、核磁共振和分子模擬解釋復(fù)合物形成機(jī)制。Del是一種第二代噁唑烷酮衍生物，尚在臨床試驗(yàn)中。223作為另一種噁唑烷酮類藥物正在進(jìn)行抗結(jié)核病的一期臨床試驗(yàn)，有關(guān)Del和223的計(jì)算報(bào)道甚少，但結(jié)構(gòu)顯示彼此在抗菌核心結(jié)構(gòu)參數(shù)較一致。

圖2 五種化合物在真空、環(huán)己烷和水環(huán)境中M06-2X/6-311+G（2d，p）優(yōu)化的主要鍵長值[單位（?）]

Lin作為第一個(gè)噁唑烷酮抗菌藥物，得到廣泛研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Lin固態(tài)物質(zhì)可能以不同的構(gòu)象形式存在，根據(jù)測定IR和熔點(diǎn)溫度，至少有四種構(gòu)象。對比晶體構(gòu)型[17]二面角參數(shù)，Lin呈第IV種構(gòu)象中的a分子狀時(shí)，其ΨN3-C10、ΨC7-N2、ΨC4-C3、ΨC3-N1和ΨN1-C2值分別為-167（1）°、 -172（1）°、 -63（1）°、 -104（1）°和171（2）°，我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）在真空計(jì)算的數(shù)值分別為-165°、-175°、-60°、-76°和172°，彼此吻合較好。a和b分子形態(tài)差異在于嗎啉環(huán)的構(gòu)象具有互補(bǔ)性。通過計(jì)算數(shù)據(jù)分析，五種化合物核心部分整體受兩端基團(tuán)變化影響不大。溶劑環(huán)境對結(jié)構(gòu)影響也不明顯。

圖3 五種化合物在真空、環(huán)己烷、水和甲醇環(huán)境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的IR吸收光譜

2.3 電子結(jié)構(gòu) 五種化合物的前線軌道HOMO和LUMO分布分析顯示，除Del的HOMO是由三嗪環(huán)中氮2p軌道構(gòu)成的π鍵，其余都由氟代苯環(huán)的π鍵構(gòu)成。五種化合物L(fēng)UMO軌道構(gòu)成類似，其中19c和Del構(gòu)成比例和相位一致，Sut、223和Lin構(gòu)成類似，但占比逐漸降低，在等密度值為0.05情況下，Lin的軌道組成更加分散。五種化合物都有極性，M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算真空中極性大小是Lin（2.85μ）＜Sut（3.00μ）＜19c（3.45μ）＜223（3.77μ）＜Del 6.28μ），水溶劑環(huán)境中Lin（4.63μ）＜Sut（4.75μ）＜19c（5.17μ）＜223（5.48μ）＜Del（9.18μ），反映出化合物極性越大，在極性環(huán)境中極性改變也越大。

2.4 IR光譜 五種化合物中，Lin已應(yīng)用于臨床，針對Lin的各項(xiàng)研究較多[18-19]。我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）在四種環(huán)境下分別計(jì)算了五種化合物的IR振動吸收光譜（見圖3），整體而言，在真空、環(huán)己烷、甲醇和水環(huán)境中，五種化合物對應(yīng)振動頻率基本呈現(xiàn)紅移現(xiàn)象，如噁唑烷酮中C=O的頻率下降約70 cm-1，酰基中的C=O則下降約55 cm-1，N-H擺動頻率受環(huán)境影響可忽略。苯環(huán)的特征峰整體紅外強(qiáng)度比較低。

真空中Lin的兩個(gè)羰基理論伸縮振動頻率為1 871 cm-1和1 787 cm-1，而文獻(xiàn)[19]測定VCD數(shù)據(jù)為1 744 cm-1和1 663 cm-1，兩者之間相較，理論計(jì)算的校正因子為0.930。MICHALSKA等[15]采用IR和NMR手段分析了Sut在環(huán)糊精β-CD中手性識別的譜學(xué)特征，并用B3LYP/6-31G*方法計(jì)算了單一Sut分子和用HF/6-31G*計(jì)算了復(fù)合體系。Sut的特征峰在噁唑烷酮的C-O鍵1 012 cm-1，噁唑烷酮的CH2對稱擺動1 416 cm-1，乙酰氨基中的C-N伸縮振動頻率1 518 cm-1，而C=O鍵在1 665 cm-1和1 745 cm-1出現(xiàn)。對比我們計(jì)算的Sut在甲醇中IR吸收譜，C=O鍵在1 721 cm-1和1 804 cm-1出現(xiàn)，而特征峰分別在1 045 cm-1、1 457 cm-1和1 560 cm-1，彼此吻合非常好。此后MICHALSKA等[16]報(bào)道了Sut合成中間體的IR和Raman數(shù)值，結(jié)合B3LYP/6-311G（d，p）計(jì)算分析，對比本研究M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算數(shù)值，基本上高5～40 cm-1。

2.5 UV-Vis光譜 五種化合物用M06-2X/6-311+G（2d，p）在真空、環(huán)己烷、水和甲醇中計(jì)算得到的UV-Vis吸收光譜曲線見圖4。五種化合物在150～320 nm范圍均有兩個(gè)吸收峰，其中遠(yuǎn)紫外區(qū)180～200 nm和近紫外區(qū)220～320 nm理論計(jì)算各有一個(gè)吸收峰。溶劑效應(yīng)對223影響最小，對Sut和Del吸收峰強(qiáng)度影響最為明顯，呈現(xiàn)遠(yuǎn)紫外藍(lán)移近紫外紅移大約5 nm，這有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。紫外吸收光譜來源主要是HOMO軌道電子向LUMO+2躍遷，而Del則是HOMO軌道電子向LUMO躍遷，貢獻(xiàn)率達(dá)到86%。

圖4 五種化合物在真空、環(huán)己烷、水和甲醛環(huán)境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的UV-Vis吸收光譜

在幾何結(jié)構(gòu)分析部分，顯示Lin是IV型中的a分子態(tài)，在甲醇中近紫外最大吸收峰對應(yīng)的是242.3 nm，與實(shí)驗(yàn)[18]上用245.6 nm測定值接近。MICHALSKA等[16]實(shí)驗(yàn)顯示Sut的R和S構(gòu)型在水中時(shí)在200 nm和250 nm處有吸收峰，在甲醇中時(shí)，R和S構(gòu)型可能在190 nm和260 nm處有最大吸收峰，另外溶劑環(huán)境對UV-Vis吸收光譜影響差異明顯，而我們計(jì)算溶劑模型簡單，區(qū)分不明顯，但計(jì)算的最大吸收波數(shù)比較接近。其他化合物的實(shí)驗(yàn)報(bào)道甚少，化合物19c UV-Vis吸收光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未見報(bào)道。

圖5 五種化合物在水和甲醇中M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的ECD譜

2.6 ECD分析 由于五種化合物中都至少有一個(gè)手性中心，而19c是兩個(gè)，分別是3S和3aS。目前計(jì)算顯示五種化合物在水中和甲醇中的ECD譜是高度吻合，見圖5。由于其整體結(jié)構(gòu)差異明顯，五種化合物的ECD峰形不同，而手性微環(huán)境Sut、223和Lin比較一致。MICHALSKA等[15]在手性識別實(shí)驗(yàn)中測定Sut在水和甲醇中的ECD，可能存在構(gòu)型變化，結(jié)果認(rèn)為圖譜不適合其實(shí)驗(yàn)解釋，后來他們對Sut手性池合成中間體和終產(chǎn)物進(jìn)行譜學(xué)分析[16]。我們用M06-2X/6-311+G（2d，p）方法結(jié)合極化連續(xù)介質(zhì)模型計(jì)算甲醇中的單一構(gòu)象的ECD，在CES分布上與實(shí)驗(yàn)一致，波數(shù)上也十分接近。FRELEK等[19]對Lin進(jìn)行ECD和VCD測定，主要是構(gòu)象II和III，而我們計(jì)算比較確認(rèn)是構(gòu)象IV中a分子態(tài)。對ECD曲線的細(xì)致分析表明，在構(gòu)象II中，在221 nm左右存在一個(gè)相對較強(qiáng)的負(fù)帶，并且在構(gòu)象III的ECD光譜中沒有這種負(fù)帶。因此，這個(gè)帶可以被認(rèn)為是區(qū)分Lin的兩種構(gòu)象的診斷帶。其他三種化合物實(shí)驗(yàn)測定報(bào)道較少，我們的計(jì)算有待實(shí)驗(yàn)測定。

2.7 分子靜電勢分布圖 五種抗MDR-TB分子表面靜電勢如圖6所示，藍(lán)色區(qū)域表示負(fù)電荷區(qū)域，易受到親電試劑的進(jìn)攻；紅色區(qū)域表示正電荷區(qū)域，易受到親核試劑的進(jìn)攻；白色表示零電位區(qū)域。其中，黃球?qū)?yīng)靜電勢極大值點(diǎn)，青球?qū)?yīng)極小值點(diǎn)。根據(jù)圖6，我們發(fā)現(xiàn)靜電勢的極小值點(diǎn)大多位于噁唑烷酮的羰基氧、乙酰基氧和三嗪環(huán)氮附近，而極大值點(diǎn)大多位于氨基氫、亞甲基和端甲基氫附近。同時(shí)發(fā)現(xiàn)19c、Sut與Lin靜電勢分布比較接近，而Del出現(xiàn)6處極值點(diǎn)，223有5個(gè)位點(diǎn)。

圖6 五種化合物在真空、環(huán)己烷和水環(huán)境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的靜電勢圖

2.8 全局反應(yīng)性描述符 五種化合物的全局反應(yīng)性參數(shù)見表1。以Lin為參考，真空中Sut的μ最低，說明其穩(wěn)定性較好，19c居中；在水環(huán)境中則是19c最低。在水環(huán)境中19c、Sut和Lin的化合物整體硬度η較大且比較接近，說明它們對微干擾下化學(xué)體系電子云畸變的抵抗能力較強(qiáng)，分子穩(wěn)定性較高；整體親電指數(shù)隨著環(huán)境極性增加而下降，化合物19c在水中ω表明其得電子能力強(qiáng)，反應(yīng)活性較高。前線軌道能差19c與Lin比較接近，EA值均比較小或?yàn)樨?fù)值，說明五種化合物整體對電子的束縛能力較弱，得電子的趨勢很小。從全局反應(yīng)性描述符分析，五種分子間差距都較小，作為同類藥物具有很高的相似性，也客觀反映出Lin作為已經(jīng)使用的藥物的合理性，其余在進(jìn)行臨床研究的化合物，具有很大的成藥潛力。

2.9 藥代動力學(xué)評價(jià) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)顯示具有潛在藥效的許多化合物因安全性、有效性和藥代動力學(xué)等問題而被淘汰。通過ACD/Labs Percepta軟件，可預(yù)測化合物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性及理化性質(zhì)等方面性質(zhì)。如Lipinski規(guī)則是廣泛用于判定化合物類藥性是否良好的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，類藥性的篩選有利于獲得藥動學(xué)、藥效學(xué)性質(zhì)平衡的候選藥。計(jì)算發(fā)現(xiàn)五種化合物均符合Lipinski規(guī)則，類藥性較好，化合物19c在胃（logD-pH 1.70）和血液（logD-pH 7.40）中分布系數(shù)比Lin更優(yōu)。

藥代動力學(xué)性質(zhì)是成藥的重要指標(biāo)之一[20]，五種化合物的藥動學(xué)相關(guān)參數(shù)預(yù)測結(jié)果見表2。五種化合物均不是糖蛋白（P-gp）的底物（P-gp是一種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，表達(dá)于各種具有分泌功能的細(xì)胞上，如腸上皮細(xì)胞和腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上[21]）。五種化合物對肝臟的主要代謝酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）的抑制作用都比較弱或無抑制作用，Lin對五種代謝酶整體抑制作用最弱，19c對CYP1A2亞型，化合物19c和Sut對CYP3A4亞型稍微有抑制作用?；蚨拘裕ˋmes反應(yīng)）指標(biāo)顯示五種化合物可能有輕微的基因毒性。hERG指標(biāo)反映五種化合物可能有輕微的心臟毒性。Caco-2（Caco-2細(xì)胞內(nèi)有藥物代謝酶，Caco-2細(xì)胞模型可用于研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和預(yù)測藥物腸吸收的體外篩選[22]）結(jié)果表明Del化合物的吸收性極差，其余均相近，19c優(yōu)于Lin。血漿蛋白結(jié)合率（plasma protein binding，PPB）會影響半衰期、清除率、藥物分布等藥代動力學(xué)參數(shù)[23]。19c和Sut與血漿蛋白結(jié)合強(qiáng)度中等，而Lin與血漿蛋白結(jié)合能力較弱。五種化合物在代謝穩(wěn)定性方面比較接近。而ZHAO等[5]的系列細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)，19c與Sut和Lin相比均接近或更優(yōu)，而體外抗結(jié)核菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）更低，體外抗耐藥結(jié)核菌比Sut和Lin的MIC要低2～10倍，hERG K+毒性在30 mmol/L以上。一項(xiàng)為期4周的大鼠毒理學(xué)研究顯示，19c比Lin骨髓抑制作用更小，為噁唑烷酮類的突破?；衔?9c在小鼠結(jié)核病菌感染模型中體內(nèi)療效優(yōu)于Lin和Sut。五種化合物穿過血腦屏障都不易，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的濃度低，Del在腸道吸收（human intestinal absorption，HIA）比其他四種弱。

表1 五種化合物在真空、環(huán)己烷和水環(huán)境中M06-2X/6-311+G（2d，p）計(jì)算的全局反應(yīng)性描述符（eV）

表2 五種化合物的藥代動力學(xué)參數(shù)

綜上所述，本研究在M06-2X/6-311+G（2d，p）水平下，對五種MDR-TB治療藥物和潛在藥物化合物的藥效構(gòu)象、幾何和電子結(jié)構(gòu)、IR等系列譜學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了計(jì)算分析，并結(jié)合概念密度泛函數(shù)預(yù)測整體反應(yīng)指數(shù)，再利用ACD/Labs Percepta軟件預(yù)測化合物的ADME/Tox和成藥性。新化合物19c增加一個(gè)手性中心形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)大大減少藥效構(gòu)象，五種化合物都是噁唑烷酮類抗結(jié)核菌化合物，在不同溶劑環(huán)境中，藥效結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)值基本一致，與晶體參數(shù)吻合較好。極性環(huán)境使Del極性改變最大，其HOMO分布與其他四種不同。該方法計(jì)算的IR光譜采用0.930校正因子后與實(shí)驗(yàn)和其他計(jì)算方法吻合很好。Lin的計(jì)算最大吸收波數(shù)與實(shí)驗(yàn)完全一致，除Del紫外吸收光譜是HOMO電子向LUMO躍遷為主外，其他均是HOMO向LUMO+2躍遷為主，都具有雙峰曲線。Sut計(jì)算的ECD峰與實(shí)驗(yàn)相吻合。19c、Sut和Lin靜電勢分布主要集中在噁唑烷酮端，而Del和223另一端呈電勢負(fù)性。8種全局反應(yīng)性描述符顯示五種化合物彼此數(shù)值接近，具有相同母核的不同衍生物，具有明顯的類藥性。類藥性評價(jià)顯示Del分布系數(shù)與其他差別大外，基本比較接近。藥代動力學(xué)參數(shù)五種化合物比較一致，但臨床用藥Lin的參數(shù)更優(yōu)。