饒大龐，項(xiàng)之洋，虞海峰

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325027

前列腺癌是第二常見的男性惡性腫瘤，也是男性癌癥死亡的第四大原因[1]。亞洲男性前列腺癌的發(fā)病率和病死率在過去幾十年里迅速上升，大多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期[2]。本課題檢測(cè)cGMP依賴蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase type I，PRKG1）在前列腺癌中的表達(dá)，研究PRKG1敲除對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響，為探尋前列腺癌新的治療靶標(biāo)提供思路[3]。

1 材料和方法

1.1 材料 75例前列腺癌組織和12例正常前列腺組織及相關(guān)臨床資料由西安艾麗娜生物科技有限公司提供，包括PRKG1表達(dá)組織芯片免疫組化結(jié)果、前列腺癌的臨床病理特征（組織病理學(xué)和組織學(xué)分級(jí)）。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第8版。病理特征評(píng)價(jià)采用Gleason評(píng)分。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2021-K-01-01）。

抗PRKG1、β-微管蛋白（β-Tubulin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、埃茲蛋白（Ezrin）、鈣黏附蛋白-2（cadherin-2，CDH-2）、Bax、Bcl-2及鈣黏附蛋白-1（cadherin-1，CDH-1）的一抗購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗（pv6001）購自北京中衫金橋公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司。人前列腺癌細(xì)胞系22RV1購自上海烜雅生物科技有限公司。攜帶Cas9和gRNA的質(zhì)粒載體由杭州擎科生物科技有限公司構(gòu)建及驗(yàn)證。CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。DAB顯色試劑盒20×（ZLI-9018）購自北京中衫金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：組織微陣列玻片的HE染色采用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。載玻片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇漂洗、重新水化。抗原修復(fù)采用枸櫞酸緩沖液。將陣列浸泡在3%過氧化氫緩沖液中30 min來淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。用PRKG1一抗（1:50）孵育后，4 ℃過夜（16～18 h）。37 ℃水浴復(fù)溫30 min，PBS浸泡5 min 3遍。滴加二抗，常溫20 min；PBS浸泡5 min 3遍。DAB顯色，隨后自來水沖洗。蘇木素復(fù)染20 s，自來水沖洗。浸入PBS溶液3～5 s返藍(lán)；立即蒸餾水沖洗。依次浸泡75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各5 min，二甲苯中各10 min脫水。切片上滴加中性樹膠，蓋玻片覆蓋，封片。

每個(gè)標(biāo)本均在光學(xué)顯微鏡（BX40，日本奧林帕斯）下檢查，以確定組織病理學(xué)特征和抗PRKG1免疫反應(yīng)性。由兩位資深病理醫(yī)師雙盲評(píng)分，結(jié)果一致者為最后判定結(jié)果。免疫組化結(jié)果判定[4]：陽性染色定位于細(xì)胞漿，采用下述方法對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析：首先按陽性強(qiáng)度評(píng)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕色；再將陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，0～10%為1分，10%～50%為2分，≥50%為3分。綜合陽性強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：兩者的乘積為最后得分，得分＞5分為陽性，≤5分為陰性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人前列腺癌細(xì)胞系22RV1培養(yǎng)于RPMI1640含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，37 ℃，5%CO2孵育。以每孔4×105個(gè)細(xì)胞種入6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液。用0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度。

1.2.3 CRISPR/Cas9敲除：首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)在22RV1細(xì)胞中敲除PRKG1的表達(dá)。將已建立的菌落命名為22RV1-KO，并以22RV1細(xì)胞（22RV1-CON）為對(duì)照。用于構(gòu)建人類PRKG1基因gRNA 2個(gè)引物包括PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-F1：5"-CACCGACATCGG CCCGCGGACCACC-3"、PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-R1：5"-AAACGGTGGTCCGCGGGCCGATGTC-3"和PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-F2：5"-CACCGTCCTTCCACGACCTGCGCC-3’、PRKG1-Mus-EXON1-gRNA-R2：5"-AAACGGCGCAGGTCGTGGAAGGAC-3"。根據(jù)生產(chǎn)廠家的操作規(guī)程，將攜帶cas9和2個(gè)gRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入22RV1細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的22RV1-KO細(xì)胞系。另外將單純cas9的對(duì)照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入22RV1細(xì)胞獲得穩(wěn)定的22RV1-CON對(duì)照組細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染3 d后，在96孔板上以0.5個(gè)細(xì)胞/孔為單位進(jìn)行限制稀釋法。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合度時(shí)，用100 μmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。用Western blot法檢測(cè)每個(gè)克隆的PRKG1蛋白表達(dá)。隨后使用PRKG1蛋白非表達(dá)克隆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞增殖：用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種到96孔板中。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃，5% CO2孵育2 h。在450 nm波長處測(cè)定吸光度。

1.2.5 遷移和侵襲：遷移和侵襲通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，小室底膜的上室表面涂覆并放置在37 ℃下30 min。細(xì)胞（2×105）懸浮在500 μL無血清培養(yǎng)基中，加入上室。下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。24 h后用3.7%多聚甲醛固定膜上的浸潤性細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲能力也用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，但時(shí)間設(shè)為48 h。隨機(jī)選擇7～10個(gè)區(qū)域來手動(dòng)計(jì)數(shù)侵襲和遷移細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算平均值。

1.2.6 Western blot：收集細(xì)胞加入含有100 μmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液，4 ℃、13 500 r/min離心10 min，取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入抗MMP9（1:1 000）、Ezrin（1:1 000）、CDH-2（1:1 000）、Bax（1:1 000）、Bcl-2（1:1 000）、CDH-1（1:1 000）和GAPDH（1:1 000）4 ℃過夜，洗膜后，加入二抗室溫溫育1 h。ECL化學(xué)顯色，ImageJ（v1.8.0）軟件分析蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。計(jì)量資料采用±s表示，2組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例和率表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)；2組細(xì)胞增殖曲線采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRKG1在前列腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床分期和Gleason評(píng)分的關(guān)系 在PRKG1陽性表達(dá)方面，主要在細(xì)胞胞漿內(nèi)觀察到棕黃色染色，表明PRKG1高表達(dá)（見圖1）。組織芯片免疫組化分析結(jié)果顯示，與正常前列腺組織組[41.7%（5/12）]相比，PRKG1在前列腺癌組織[13.3%（10/75）]中陽性率顯著降低（P=0.026），并且不同腫瘤臨床分期和不同Gleason評(píng)分前列腺癌組織的PRKG1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1 PRKG1在前列腺癌組織和正常前列腺組織中的表達(dá)情況

表1 前列腺癌組織PRKG1表達(dá)與臨床分期及Gleason評(píng)分的關(guān)系[例（%）]

2.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PRKG1基因敲除促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 Western blot結(jié)果顯示，22RV1-KO組細(xì)胞不表達(dá)PRKG1，表明22RV1-KO組細(xì)胞中PRKG1基因敲除成功（見圖2）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，與22RV1-CON組細(xì)胞相比，22RV1-KO組細(xì)胞的增殖水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。Transwell試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與22RV1-CON組細(xì)胞相比，22RV1-KO組細(xì)胞遷移及侵襲能力均加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.3 PRKG1基因敲除對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白、MMP9、細(xì)胞黏附蛋白及細(xì)胞骨架連接蛋白表達(dá)水平的影響 與22RV1-CON組細(xì)胞相比，22RV1-KO組細(xì)胞MMP9、CDH-1、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），CDH-2、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），而Ezrin蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖2 Western blot確認(rèn)22RV1細(xì)胞的PRKG1基因敲除結(jié)果

圖3 PRKG1基因敲除對(duì)22RV1細(xì)胞增殖的影響

3 討論

PRKG是廣泛存在于真核生物中的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩種主要形式的PRKG：PRKG1和PRKG2[5]。過去的研究證明，與正常組織相比，部分腫瘤組織中PRKG1水平降低，且PRKG1通過蛋白的磷酸化影響細(xì)胞的活動(dòng)[6]。人類集成蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫（the Human Integrated Protein Expression Database，HIPED）提示PRKG在外周血單核細(xì)胞和前列腺正常組織中過表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，PRKG是可能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的一種新的分子途徑[7-8]。

圖5 2組細(xì)胞MMP9、Ezrin、CDH-2、Bax、Bcl-2、CDH-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

另外有研究表明，某些抑癌基因，例如TCF12可通過cGMP-PRKG通路抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]。但也有研究表明，TMPRSS2-ERG基因融合可導(dǎo)致ERG致癌通路異常激活，強(qiáng)化前列腺癌細(xì)胞cGMP合成，導(dǎo)致PRKG活性增強(qiáng)引起細(xì)胞增殖[10]。

前列腺癌發(fā)病機(jī)制是多種遺傳因素共同參與的[11]。有研究表明PRKG1是前列腺癌進(jìn)展過程中的一個(gè)抑癌基因[9]。我們觀察到在前列腺癌組織中PRKG1較正常前列腺組織低表達(dá)，這些結(jié)果與PRKG1的抗增殖和抗腫瘤作用是一致的[12]。磷酸化是一種表觀遺傳學(xué)的機(jī)制，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7，13]，部分通路激活PRKG1可誘導(dǎo)前列腺癌的細(xì)胞凋亡，抑制前列腺癌細(xì)胞遷移[9，14]。舒林酸及其衍生物可能通過激活PRKG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以預(yù)防結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌[15-16]。

圖4 PRKG1基因敲除對(duì)22RV1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（×400）

本研究采用CRISPR/Cas9方法敲除PRKG1基因，發(fā)現(xiàn)在22RV1前列腺癌細(xì)胞中PRKG1基因的敲除降低了PRKG1的表達(dá)，同時(shí)敲除PRKG1基因后腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均上調(diào)，Western blot實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了部分凋亡蛋白在22RV1-KO細(xì)胞系中表達(dá)的異質(zhì)性。MMP9、CDH-1、Bax蛋白在22RV1-KO細(xì)胞克隆中表達(dá)下降，CDH-2、Bcl-2水平升高。MMP9雖是促癌基因，但在22RV-1中表達(dá)降低，這可能是由于cGMP激活中由NO模仿介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，在基因水平上也降低了MMP9造成[17]。CDH-1、Bax抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[18-19]，在本研究中22RV1-KO細(xì)胞克隆敲除后CDH-1、Bax表達(dá)下降，驗(yàn)證了PRKG1是抑制前列腺癌生長與轉(zhuǎn)移的。有研究報(bào)道，CDH-1可抑制惡性腫瘤發(fā)展，與BRAF、Src、AKT等多條癌癥相關(guān)信號(hào)通路存在相互作用，靶向CDH-1策略已成為當(dāng)前腫瘤防治研究突破新方向[20]。CDH-2是一種促進(jìn)惡性腫瘤的基因[21]，CDH2介導(dǎo)的細(xì)胞黏附是生存信號(hào)的重要中介，并抑制了細(xì)胞的凋亡[22]。本研究PRKG1敲除后，同時(shí)通過下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CDH-1與上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物CDH-2來影響前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。已有研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)細(xì)胞凋亡基因分為以Bax為代表的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因和以Bcl-2為代表一致細(xì)胞凋亡的基因[23]。我們的結(jié)果中凋亡蛋白Bcl-2抑制和促進(jìn)凋亡蛋白Bax升高，與我們的研究預(yù)期相符。促癌基因Ezrin比值變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與PRKG1基因無明顯相關(guān)性。

本研究結(jié)果證明了PRKG1的重要性，并為其作為前列腺癌治療藥物靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)。但研究還有很大的局限性。例如，組織芯片中并沒有患者生存期信息，研究敲除PRKG1影響的蛋白種類有限，未研究PRKG1過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響，缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。我們認(rèn)為，這個(gè)基因還需要更深入的研究評(píng)估，以便更好地理解其治療潛力。