郭永梅

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，江西 上饒 334000）

心肌缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型是一種缺血性心肌病及心臟手術(shù)后出現(xiàn)心衰的常見損傷模型[1]。近年來，研究表明，許多中藥的活性成分可以適當(dāng)?shù)販p少心肌H/R損傷[2]。三葉青是我國家特有的藥用植物，具有清熱解毒祛腫等功效[3]。迄今為止，關(guān)于三葉青總黃酮對心肌H/R損傷的保護作用鮮見報道。本研究三葉青總黃酮對H9C2細胞H/R損傷的保護作用。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

H9C2細胞（中科院上海細胞庫）。

1.2 藥物與試劑

三葉青（懷玉山）；高糖DMEM培養(yǎng)基（碧云天）；胎牛血清（四季青）。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺（安泰技術(shù)有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；IX71倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）。

2 方法

2.1 細胞的培養(yǎng)

細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中于37℃，5%CO2下培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達85%左右時傳代，每3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞接種，以便進行后續(xù)實驗。

2.2 三葉青總黃酮對H9C2細胞的活性實驗

將高糖的DMEM（含10%胎牛血清）來培養(yǎng)大鼠源永生化H9C2細胞，制成5×104mL的細胞懸液，按100μL/孔接種在96孔板，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱（含5% CO2）中孵育24 h，吸棄原培養(yǎng)液，分別用3、6、9、18、36、72μg·mL-1等濃度的三葉青總黃酮處理24 h。結(jié)束前4 h加入1.9 mg·mL-1的MTT液20μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用到酶標儀于490 nm波長進行檢測光的密度D（λ）值。

2.3 H9C2細胞H/R模型的建立

按2.2項處理，用DMEM培養(yǎng)液配制氯化鈷的溶液，濃度在600～1 600μmol·L-1之間，分別于6 h、12 h、18 h、24 h確定氯化鈷的濃度及缺氧的時間。估約最佳的復(fù)氧時間，缺氧的時間完成后，摒棄那些缺氧的液體，用高糖的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）分別進行復(fù)氧1 h、2 h、3 h、6 h。

2.4 藥物處理

實驗為正常的組，H/R的模型的組和三葉青總黃酮低的（3μg·mL-1）、中的（6μg·mL-1）、高的（9μg·mL-1）濃度預(yù)處理的組。

2.5 指標檢測

按試劑盒檢測SOD、LDH、MTT及Westen blot測定DJ-1蛋白表達。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS17.0分析，計量用mean±sd表示，方差分析比較組與組之間的差別。

3 結(jié)果

3.1 三葉青總黃酮對H9C2細胞成活率的影響

結(jié)果如圖1所示，當(dāng)藥物的濃度達到了9μg·mL-1時，H9C2細胞的成活率顯著高于空白對照組，但是隨著藥物的濃度的逐漸提高，H9C2細胞的成活率則逐漸地降低，故而以三葉青總黃酮9μg·mL-1為最高地濃度，依次設(shè)定低、中、高濃度分別為3、6、9μg·mL-1。

圖1 三葉青總?cè)~黃酮對H9C2細胞成活率的影響

3.2 H9C2細胞H/R模型的建立

當(dāng)氯化鈷地濃度為1 200μmol·L-1，缺氧地時間為18 h，復(fù)氧地時間就為2 h是本實驗細胞H/R損傷模型的最佳地條件。

3.3 三葉青總黃酮對H/R損傷大鼠源永生化H9C2心肌細胞成活率的影響

結(jié)果如圖2所顯示，與模型地組相對比，三葉青總黃酮6、9μg·mL-1組細胞成活率顯著升高（P＜0.05）。

3.4 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2細胞上清液中LDH及細胞內(nèi)SOD水平的影響

比較正常對照地組，模型地組的上清液中的LDH及細胞內(nèi)MDA水平明顯提高，細胞內(nèi)SOD活性明顯下降（P＜0.05）。

3.5 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2心肌細胞DJ-1蛋白表達的影響

結(jié)果如圖3所示，比較正常對照的組，模型的組的DJ-1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。比較模型的組，三葉青總黃酮中劑量的組、高劑量的組DJ-1蛋白表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 不同復(fù)氧時間對H9C2細胞成活率的影響

圖3 三葉青總黃酮對H/R損傷H9C2心肌細胞DJ-1蛋白表達的影響（*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較）

4 結(jié)語

實驗的結(jié)果顯示，經(jīng)三葉青總黃酮的處理后，細胞內(nèi)的MDA含量下降，而SOD的活性增加，由此可以看出，三葉青總黃酮能降低細胞的H/R的損傷。