李 涵 李雨芯 張 茹 李美欣 王一鳴

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，是HIF家族的一員；其參與多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)[1]。在低氧時(shí)，可以被激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，在許多病理、生理應(yīng)激等功能活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[2]。有研究報(bào)道，抑郁模型大鼠腦組織及心肌組織HIF-1α表達(dá)增加，推測(cè)HIF-1α的變化可能抑郁癥的病理發(fā)生過(guò)程有關(guān)[3]。

機(jī)體在正常功能活動(dòng)中，經(jīng)常會(huì)面臨許多內(nèi)外環(huán)境的變化，而體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一些代謝反應(yīng)和生理調(diào)節(jié)，來(lái)應(yīng)對(duì)這些變化；特別是一些有害因素，長(zhǎng)期作用可引起機(jī)體受到損害。研究表明，長(zhǎng)期慢性應(yīng)激可引起小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為和學(xué)習(xí)記憶功能減退[4]。因此，我們推測(cè)，在一定的應(yīng)激強(qiáng)度下，小鼠處于一定的低氧狀態(tài)而引起小鼠的行為發(fā)生改變，且與HIF-1α的表達(dá)存在著一定的聯(lián)系。本研究采用2周、4周和6周不同時(shí)程應(yīng)激處理小鼠，檢測(cè)小鼠的焦慮絕望程度，以及腦內(nèi)HIF-1α的表達(dá)，探討長(zhǎng)期慢性應(yīng)激條件下，小鼠行為學(xué)的改變與HIF-1α的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明品系小白鼠SPF級(jí)，9～12周齡，雌雄各半。購(gòu)置于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。購(gòu)買后的飼養(yǎng)在小鼠籠中，自由飲水進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下適應(yīng)一周。按隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)分為對(duì)照組和應(yīng)激組，每組12只。分別慢性應(yīng)激2周、4周和6周后，對(duì)小鼠進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠行為能力的變化。

1.2 慢性應(yīng)激方案

應(yīng)激組小鼠采取冰水游泳：6℃水溫，游泳3 min；禁食36 h，高臺(tái)應(yīng)激1 h/天（每只小鼠獨(dú)立設(shè)置，平臺(tái)高1.6 m；通宵照明，禁水24 h，斜籠：將小鼠籠傾斜約40°，持續(xù)36 h；電擊足底：通過(guò)銅柵輸出電脈沖36 V，10 s/次，累計(jì)30次。每天隨機(jī)選擇一種應(yīng)激方式，對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)。

1.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

把小鼠放入圓形水桶中，水桶直徑20 cm，水深25 cm。觀察記錄在小鼠在6 min內(nèi)，初始潛伏期（從放入水中到不掙扎）和后4 min內(nèi)小鼠總共不掙扎的時(shí)間。在水中小鼠掙扎或不掙扎反映小鼠的行為絕望程度。

1.4 檢測(cè)小鼠腦海馬和前腦HIF-1α的表達(dá)

分別在2周、4周和6周后，進(jìn)行取材。用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，常規(guī)灌流取腦技術(shù)取小鼠全腦，固定系系列處理后石蠟冠狀切片。兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體武漢博士德生物公司產(chǎn)品，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行小鼠腦切片的免疫組織化學(xué)，檢測(cè)小鼠相關(guān)腦區(qū)HIF-1α的表達(dá)情況。具體腦區(qū)涉及小鼠海馬CA1區(qū)、齒狀回（DG）以及前腦皮層（PFC）。采用Motic Images Advanced3.2圖像處理系統(tǒng)計(jì)算HIF-1α陽(yáng)性神經(jīng)元平均目標(biāo)灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±S E）的方式來(lái)表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）后，進(jìn)行Newman-Keuls差異比較各組，以及非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的行為絕望程度

強(qiáng)迫游泳懸尾實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激組小鼠在應(yīng)激4周和6周后，與對(duì)照組相比（見(jiàn)表1），初始潛伏期均明顯減少，而總計(jì)不掙扎時(shí)間增加（P<0.05；P<0.05）。結(jié)果說(shuō)明，應(yīng)激2周對(duì)小鼠的情緒無(wú)顯著影響；應(yīng)激4周后，小鼠出現(xiàn)絕望狀態(tài)。

表1 不同應(yīng)激時(shí)間小鼠的絕望程度

2.2 不同應(yīng)激時(shí)間后小鼠海馬和前腦HIF-1α的表達(dá)情況

通過(guò)對(duì)免疫組織化學(xué)染色后各腦區(qū)HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值進(jìn)行測(cè)量（見(jiàn)表2），應(yīng)激2周后，應(yīng)激組小鼠DG區(qū)灰度值顯著減少（P<0.05）；應(yīng)激4周和6周后，PFC、CA1區(qū)和DG區(qū)灰度值都明顯增加（P<0.05，P<0.01）。說(shuō)明應(yīng)激2周后海馬DG區(qū)HIF-1α表達(dá)顯著增加；應(yīng)激4周和6周后，各腦區(qū)HIF-1α表達(dá)均顯著降低。

表2 不同應(yīng)激時(shí)間小鼠腦區(qū)HIF-1α表達(dá)

3 討論

我們先前的研究表明，一次性的電擊足底應(yīng)激，可引起小鼠海馬和前腦的HIF-1α表達(dá)增加[5]，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，可以推測(cè)，小鼠腦內(nèi)HIF-1α的變化與其腦功能的改變密切相關(guān)。HIF-1由α亞基和β亞基組成，HIF-1α在機(jī)體內(nèi)感受氧的改變中具有重要作用。已經(jīng)明確，HIF-1α表達(dá)的增加，可降低細(xì)胞由于缺血缺氧的損傷，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起一定的保護(hù)作用[6]。

本研究中，采用不同方式的應(yīng)激處理，刺激持續(xù)2周、4周和6周，目的是研究不同的應(yīng)激時(shí)間，小鼠的自發(fā)活動(dòng)和絕望程度，以及腦內(nèi)HIF-1α的表達(dá)的變化。結(jié)果表明，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，2周的時(shí)間內(nèi)，小鼠行為的沒(méi)有明顯改變，腦內(nèi)HIF-1α表達(dá)可見(jiàn)輕度增加但不顯著；而慢性應(yīng)激4周后小鼠的自發(fā)活動(dòng)明顯減少、行為絕望程度增加，同時(shí)海馬和前腦HIF-1α的表達(dá)也減少；慢性應(yīng)激6周，小鼠的表現(xiàn)就更加明顯。這可以說(shuō)明，小鼠的行為學(xué)變化與腦內(nèi)HIF-1α的表達(dá)密切相關(guān)；HIF-1α表達(dá)的減少可能為小鼠抑郁樣行為增強(qiáng)的機(jī)制之一。