方平，王靜玉，許周亮，孫剛強，荀玉月，汪佩*

1浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院麻醉科，浙江寧波 315000；2浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院手術(shù)室，浙江寧波 315000

慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)引起的神經(jīng)病理性疼痛在我國人群中發(fā)病率高達8.2%，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致部分患者功能喪失、殘疾[1-3]。低強度運動指運動時所測得的心率≤40%最大運動心率的運動強度。有研究證實規(guī)律運動具有一定的鎮(zhèn)痛作用[4-5]，是臨床實踐指南推薦的一項減輕慢性疼痛和促進神經(jīng)功能恢復(fù)的策略。Lopes等[6]發(fā)現(xiàn)，進行規(guī)律的有氧運動可減輕疼痛，同時白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)水平較運動前有所升高；Kiguchi等[7]發(fā)現(xiàn)，將IL-4注射至小鼠神經(jīng)損傷部位可有效減輕疼痛。本研究通過構(gòu)建小鼠CCI模型，探討低強度運動是否通過IL-4介導(dǎo)從而對神經(jīng)病理性疼痛小鼠發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠IL-4受體拮抗劑(IL-4Ra，P Z 0 3 6 3-5 M G)、抗神經(jīng)生長因子單克隆抗體(N3279)以及IL-4、IL-1β ELISA試劑盒(RAB030、RAB0275)購自美國Sigma公司；小鼠抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)單克隆抗體(JLC4037)以及IL-5、IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(JLC3600、JLC3582、JLC3924)購自上海晶抗生物工程有限公司；神經(jīng)生長因子-β(nerve growth factor-β，β-NGF)ELISA試劑盒(96T)購自北京百奧萊博科技有限公司。小動物跑步機(SA101)購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；電子機械痛閾測試儀(2390-5)、爪熱痛測試儀(3730)購自美國IITC公司；纖毛機械刺激針購自上海玉研科學儀器有限公司；恒溫手術(shù)臺(Size1)購自美國Harvard公司；臺式高速冷凍離心機(M1324R)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性C57/BL6小鼠48只，8周齡，20～30 g，由寧波大學動物實驗中心提供。小鼠于21～23 ℃和50%～80%濕度條件下飼養(yǎng)，12h /12 h光/暗循環(huán)，給予鼠類標準顆粒飼料(寧波大學實驗動物中心提供)并自由飲水。采用隨機數(shù)字表法分為6組(n=8)：假手術(shù)/靜坐組(SS組)、假手術(shù)/生理鹽水/運動組(SNE組)、假手術(shù)/抗IL-4/運動組(SAE組)、CCI/靜坐組(CS組)、CCI/生理鹽水/運動組(CNE組)、CCI/抗IL-4/運動組(CAE組)。分組及各組處理詳情如圖1所示。實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

圖1 各組小鼠處理流程Fig.1 Processing flow chart of mice in each group

1.3 神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型制備 參照文獻[8]的方法制備CCI小鼠模型：小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.04 mg/g麻醉后取側(cè)臥位，消毒鋪巾，切開右下肢股部皮膚，逐層分離直至完整暴露坐骨神經(jīng)，于主干部位用4-0鉻制羊腸線松扎4道間距為1 mm的松結(jié)扎，結(jié)扎強度以大腿產(chǎn)生1個小的短暫性抽搐為宜，結(jié)扎后逐層縫合切口觀察至麻醉蘇醒，假手術(shù)組小鼠僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎。通過測定并對比損傷側(cè)與對側(cè)機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)剔除不合格樣本，確定造模成功。

1.4 小鼠行為學測試 所有小鼠均以術(shù)前3 d(T0)的行為學測試結(jié)果作為基線值，造模后第1－15天運動組行低強度跑步機運動，造模后第3(T1)、7(T2)、11(T3)、15(T4)天進行行為學測試以分析小鼠痛覺過敏的差異。

1.4.1 PWMT 將小鼠放入測試框內(nèi)并置于網(wǎng)格面板上適應(yīng)0.5 h，待小鼠安靜后測定機械痛閾值。將纖毛機械刺激針固定于支架上，開啟并調(diào)零測痛儀，鈍性探針以恒定速度垂直向上刺激小鼠右足底正中皮膚，至出現(xiàn)舔足或縮足時記錄針刺力度(g)即為PWMT，每次測定間隔至少5 min，相同的爪子重復(fù)測5次，除去最大值和最小值后取3次數(shù)據(jù)平均值作為小鼠后爪的PWMT值。

1.4.2 熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL) 將小鼠放入測試框內(nèi)適應(yīng)0.5h，待小鼠安靜后，設(shè)置爪熱痛測試儀的紅外熱輻射強度為60%且單次加熱刺激最長時間為20 s，以避免熱輻射損傷動物足底組織影響后續(xù)實驗的準確性。調(diào)整光源正對于小鼠右側(cè)足底正中后開始計時，記錄出現(xiàn)舔足或縮足反射時的持續(xù)光照時間即為PWTL。每次測定間隔至少5 min，相同的爪子重復(fù)測5次，除去最大值和最小值后取3次數(shù)據(jù)平均值作為小鼠后爪的PWTL值。

1.5 IL-4Ra預(yù)處理 為明確IL-4介導(dǎo)運動對CCI小鼠的鎮(zhèn)痛作用，SAE組、CAE組小鼠運動前30 min腹腔注射IL-4Ra 50 μg，SNE組、CNE組在相同時間點腹腔注射等量生理鹽水。

1.6 小鼠低強度跑步機運動 造模后第1－15天，將SNE組、SAE組、CNE組、CAE組小鼠放置于跑步機上開始低強度有氧跑步機跑步，1次/d，30 min/次(無傾斜度，10 m/min，5 d/周)。

1.7 ELISA檢測坐骨神經(jīng)和腰段脊髓(L1～L6)細胞因子水平 造模后第15天完成最后一次行為學測試后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.04 mg/g麻醉小鼠，斷頭處死，取損傷側(cè)坐骨神經(jīng)和腰段脊髓(L1～L6)，采用ELISA法檢測IL-4、IL-1Ra、IL-5、TNF-α、IL-1β、BDNF、β-NGF水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，不同時間點比較采用雙因素重復(fù)測量方差分析，進一步兩兩比較采用LSD事后檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學測試結(jié)果比較 造模前各組小鼠P W MT、P W TL比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SS組、SNE組和SAE組造模前后各時間點的PWMT、PWTL差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CS組、CNE組和CAE組造模后各時間點的PWMT、P W T L 低于造模前基線值，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CS組、CNE組和CAE組造模后PWMT、PW TL低于SS組、SNE組及SAE組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CNE組造模后T3和T4時的PWMT、PWTL高于CS組，而CAE組低于CNE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2 各組小鼠坐骨神經(jīng)和腰段脊髓(L1～L6)細胞因子水平比較 SS組、SNE組和SAE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓的IL-4、IL-1Ra、IL-5、TNF-α、IL-1β、BDNF、β-NGF水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CS組、CNE組和CAE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓的IL-4、IL-1Ra、IL-5水平均低于SS組、SNE組和SAE組，TNF-α、IL-1β、BDNF、β-NGF水平高于SS組、SNE組和SAE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CNE組和CAE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓的IL-4水平均高于CS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CNE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓的IL-1Ra、IL-5水平均高于CS組和CAE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CNE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓的TNF-α、IL-1β、BDNF、β-NGF水平低于CS組，而CAE組高于CNE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CS組與CAE組坐骨神經(jīng)和腰段脊髓各細胞因子水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

3 討 論

坐骨神經(jīng)損傷后損傷部位和脊髓內(nèi)的神經(jīng)免疫相互作用在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用：神經(jīng)損傷所釋放的促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α等在疼痛的產(chǎn)生中具有重要作用[9-10]；而抗炎細胞因子如IL-5、IL-1Ra等可抑制炎癥反應(yīng)而減輕疼痛[11]；與此同時，脊髓背角中的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞被激活，釋放IL-1β、TNF-α、BDNF等促炎因子以及神經(jīng)生長因子，上調(diào)背角神經(jīng)元的興奮性，從而導(dǎo)致痛覺過敏[12]。本研究中CS組、CNE組和CAE組小鼠各時間點機械刺激痛閾值和熱痛覺過敏閾值均明顯下降，表明CS組、CNE組和CAE組小鼠較SS組、SNE組、SAE組更易發(fā)生痛覺過敏；CS組、CNE組和CAE組小鼠損傷部位和腰段脊髓的促炎細胞因子和神經(jīng)生長因子水平高于SS組、SNE組、SAE組，而抗炎因子水平低于SS組、SNE組、SAE組，提示神經(jīng)損傷后外周損傷部位和脊髓的炎癥反應(yīng)加重，同時提示造模成功。CNE組在進行2周低強度運動后PWMT和PWTL較CS組和CAE組有所上升，但仍低于假手術(shù)組，提示CCI導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛在低強度運動后有所緩解。

表1 各組小鼠不同時間點PWMT、PWTL比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of PWMT and PWTL values of mice in each group at different time points (±s, n=8)

表1 各組小鼠不同時間點PWMT、PWTL比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of PWMT and PWTL values of mice in each group at different time points (±s, n=8)

SS. 假手術(shù)/靜坐；SNE. 假手術(shù)/生理鹽水/運動；SAE. 假手術(shù)/抗IL-4/運動；CS. 慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷/靜坐；CNE. 慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷/生理鹽水/運動；CAE. 慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷/抗IL-4/運動；PWMT. 機械刺激縮足反射閾值；PWTL. 熱刺激縮足反射潛伏期；與SS組比較，(1)P<0.05；與SNE組比較，(2)P<0.05；與SAE組比較，(3)P<0.05；與CS組比較，(4)P<0.05；與CNE組比較，(5)P<0.05；與T0時比較，(6)P<0.05。

指標 SS組 SNE組 SAE組 CS組 CNE組 CAE組 F P PWMT(g)T0 3.0±0.1 3.0±0.3 2.8±0.2 3.0±0.3 3.1±0.2 3.0±0.3 1.041 0.406 T1 3.1±0.4 3.1±0.6 3.1±0.3 1.7±0.2(1)(2)(3)(6) 1.9±0.2(1)(2)(3)(6) 1.6±0.3(1)(2)(3)(5)(6) 21.880 0.000 T2 3.0±0.4 2.9±0.6 2.8±0.5 1.3±0.1(1)(2)(3)(6) 1.8±0.3(1)(2)(3)(6) 1.3±0.2(1)(2)(3)(6) 29.593 0.000 T3 2.8±0.3 2.7±0.3 2.5±0.3 1.3±0.1(1)(2)(3)(5)(6) 2.0±0.1(1)(2)(3)(4)(6) 1.2±0.1(1)(2)(3)(5)(6) 48.826 0.000 T4 2.9±0.2 2.8±0.2 2.6±0.4 1.5±0.1(1)(2)(3)(5)(6) 2.2±0.2(1)(2)(3)(4)(6) 1.4±0.2(1)(2)(3)(5)(6) 47.470 0.000 PWTL(s)T0 7.6±1.0 9.3±1.3 9.2±1.3 8.7±0.7 9.1±1.3 9.0±1.4 2.159 0.077 T1 6.5±1.1 7.6±1.0 7.8±1.5 2.7±0.8(1)(2)(3)(6) 3.5±1.1(1)(2)(3)(6) 2.6±0.7(1)(2)(3)(6) 37.534 0.000 T2 6.8±1.8 7.3±1.7 7.1±1.9 1.6±0.9(1)(2)(3)(6) 3.3±0.7(1)(2)(3)(6) 1.7±0.7(1)(2)(3)(6) 29.046 0.000 T3 7.3±1.7 7.5±2.1 7.1±1.5 2.2±0.7(1)(2)(3)(5)(6) 4.8±0.9(1)(2)(3)(4)(6) 2.2±1.0(1)(2)(3)(5)(6) 23.742 0.000 T4 6.2±0.7 7.1±1.1 7.5±1.6 1.8±0.7(1)(2)(3)(5)(6) 4.4±0.9(1)(2)(3)(4)(6) 1.5±0.7(1)(2)(3)(5)(6) 50.387 0.000

低強度運動是一種低成本、安全、有效的疼痛干預(yù)措施，深入探索其機制不僅有助于改善慢性疼痛的持續(xù)狀態(tài)，還可為臨床醫(yī)師開具廉價、安全、便捷的非藥物治療處方提供依據(jù)。多項研究表明，規(guī)律運動不僅有利于緩解疼痛，還可促進神經(jīng)保護與再生[13-14]。外周神經(jīng)損傷后大量促炎因子釋放導(dǎo)致機體局部痛閾下降，而規(guī)律的低強度運動可促進抗炎細胞因子釋放以減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮局部鎮(zhèn)痛作用[15-16]；與此同時，脊髓背角中的星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)損傷后被激活并釋放BDNF以增強背角神經(jīng)元的興奮性，而規(guī)律運動后釋放的抗炎因子可直接抑制BDNF和β-NGF的活性，脊髓背角神經(jīng)元的興奮性隨之下降，導(dǎo)致機體痛閾上升[15-16]。本研究造模后經(jīng)連續(xù)低強度運動后測得CNE組促炎因子IL-1β、TNF-α、β-NGF、BDNF水平低于CS組和CAE組，抗炎因子IL-5、IL-1Ra水平高于CS組和CAE組，提示規(guī)律低強度運動可有效減輕神經(jīng)損傷部位和中樞的炎癥反應(yīng)，同時與CNE組機械刺激痛閾和熱刺激痛閾上升的結(jié)果相互印證，表明運動可在局部和中樞同時發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，與Harris等[17]的研究結(jié)果一致。

IL-4是巨噬細胞趨化因子，由Ⅱ型輔助T細胞(Th2細胞)分泌并在炎癥反應(yīng)中起重要作用[18-19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在損傷部位或脊髓內(nèi)注射IL-4可預(yù)防神經(jīng)損傷引起的炎癥和痛覺過敏，還可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷后脊髓膠質(zhì)細胞的活化，且這種鎮(zhèn)痛機制并非通過內(nèi)源性阿片類遞質(zhì)及受體作用完成，而是與其抑制炎性因子的外周機制有關(guān)[18]；相反，IL-4表達下調(diào)或其作用被拮抗可促進IL-1β、TNF-α等炎性介質(zhì)的釋放，從而加重疼痛[20-22]。Kiguchi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IL-4可有效緩解小鼠局部神經(jīng)損傷部位的疼痛，其鎮(zhèn)痛機制為：通過脂多糖下調(diào)M1型巨噬細胞特異性分子IL-1β、CC趨化因子配體-3和CD86 mRNA的表達[22]；通過磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-6而增加M2型巨噬細胞特異性分子精氨酸酶-1、IL-10和CD206 mRNA的表達，使巨噬細胞表型從M1(炎癥型)轉(zhuǎn)為M2(抗炎型)，在神經(jīng)病理性疼痛的治療中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[23]。Okutani等[24]發(fā)現(xiàn)，IL-4可通過降低CC趨化因子配體-3和CC趨化因子受體-5的水平而抑制p38絲裂原活化蛋白激酶活化以及神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞之間的信息傳遞，進而抑制脊髓膠質(zhì)細胞活化，在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果顯示，CNE組和CAE組小鼠IL-4水平高于CS組，差異有統(tǒng)計學意義，尤其是CAE組雖與CNE組進行一致的低強度運動，但由于運動前30 min注射IL-4Ra阻斷運動經(jīng)IL-4發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，因此在行為學測試和抗(促)炎因子水平方面均與CS組結(jié)果無異且劣于CNE組，提示神經(jīng)病理性疼痛小鼠進行低強度運動所發(fā)揮的鎮(zhèn)痛作用與IL-4有關(guān)，但并不能排除低強度運動可能通過其他機制抑制TNF-α、IL-1β、BDNF、β-NGF等細胞因子而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，該結(jié)果有待進一步研究證實。綜上所述，坐骨神經(jīng)縮窄性損傷后，局部損傷部位和脊髓均會出現(xiàn)促炎因子釋放增加和抗炎因子釋放減少而導(dǎo)致機體痛覺過敏，而規(guī)律低強度運動2周后可由IL-4介導(dǎo)抗炎因子釋放增加和促炎因子釋放減少而導(dǎo)致機體痛閾上升，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

圖2 各組小鼠坐骨神經(jīng)和腰段脊髓(L1～L6)細胞因子水平比較(n=8)Fig.2 Comparison of cytokine levels in sciatic nerve and lumbar spinal cord (L1-L6) of mice in each group (n=8)