梁竹西，何欣雨，常淑芳，王志剛，郝蘭，李發(fā)琪，朱深銀*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010；3超聲分子影像學(xué)重慶市醫(yī)學(xué)重點實驗室，重慶 400010

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)[1-2]是一種自身免疫反應(yīng)所致的慢性進行性關(guān)節(jié)滑膜炎性病變，常累及關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)軟骨及周圍軟組織，病程反復(fù)，致殘率高，嚴(yán)重危害人類健康，早診斷、早治療是其治療的關(guān)鍵[3-4]。RA病程進展的主要原因為關(guān)節(jié)滑膜組織成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)[5]及巨噬細胞樣滑膜細胞具有類似腫瘤細胞的高增殖、侵襲、遷移及抗凋亡特征，如能早期監(jiān)測FLSs的異常增殖并進行干預(yù)，對緩解RA病程具有重要意義。

近年來，基于某種光敏劑(如卟啉及卟啉衍生物等)在特定波長的激光輻照后產(chǎn)生具有殺傷作用的單線態(tài)氧和活性氧(reactive oxygen species，ROS)[6]的光動力治療(photodynamic therapy，PDT)[7-8]已廣泛應(yīng)用于體表腫瘤的治療。通過PDT治療具有類似于腫瘤組織病理特性的RA滑膜炎病變，有望緩解RA的病程進展。目前，RA關(guān)節(jié)病變的影像學(xué)診斷方式主要以單一成像模式(X線、CT、MRI、超聲)為主，存在各種弊端，可導(dǎo)致早期病變的診斷準(zhǔn)確性不高。因此，探索多模態(tài)超聲分子成像[9]對RA滑膜炎早期病變的診斷價值具有重要臨床意義。本研究擬采用雙乳化法制備包載IR-820[10]和全氟正戊烷(perfluoropentane，PFP)[11]的聚乳酸羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)納米粒(IR-820/PFP@PLGA)，一方面基于IR-820的光熱轉(zhuǎn)換性能促使PFP相變，賦予該納米粒增強超聲成像的能力，實現(xiàn)RA滑膜病變的超聲成像及光聲成像診斷；另一方面基于IR-820的光動力作用，使IR-820/PFP@PLGA納米粒能對RA滑膜病變中增殖及炎癥激活的FLSs細胞進行光動力治療，以探索RA滑膜病變診療一體化的可能。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 羧基端乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，分子量12 kD，聚合比50:50)購自濟南岱罡生物工程有限公司，異丙醇、IR-820購自美國Sigma-Aldr ich公司，全氟正戊烷(perfluoropentane，PFP)購自北京百靈威科技有限公司，胰酶細胞消化液、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二氯甲烷購自重慶川東化工公司，瓊脂糖購自美國Life Technologies公司，酶標(biāo)儀、單線態(tài)氧熒光(SOSG)探針、DMEM 培養(yǎng)基購自美國ThermoFisher公司，胎牛血清購自美國HyClone公司，RA FLSs MH7A細胞株購自北京BioVector NTCC公司，CCK-8試劑盒購自日本東仁公司。倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，馬爾文粒徑分析儀購自英國Malvern公司，UV-2550紫外分光光度計、熒光分光光度計購自美國Agilent公司，Sonics & Materials聲振儀購自美國Sonic公司，808 nm激光儀購自西安中川光電科技有限公司，Mylab 90超聲診斷儀購自意大利百勝公司，光聲成像儀購自加拿大Visual Sonics公司，透射電子顯微鏡購自日本Hitachi公司，熱成像儀購自上海Fotric公司，流式細胞儀購自美國BDInflux公司。

1.2 IR-820/PFP@PLGA納米粒的制備及基本表征檢測

1.2.1 納米粒的制備 將2 ml濃度為25 mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液、1 ml濃度為2 mg/ml IR-820水溶液、200 ml PFP混合，用聲振儀聲振3 min后，加入5 ml 5% PVA水溶液，再聲振3 min后，用磁力攪拌器攪拌4 h，使二氯甲烷充分揮發(fā)。最后用低溫離心機離心洗滌至上清澄清后獲得IR-820/PFP@PLGA納米粒，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽淙^程避光冰浴。

1.2.2 納米粒的基本表征檢測 將IR-820/PFP@PLGA納米粒用去離子水重懸，稀釋100倍后通過光學(xué)顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)及分布，透射電子顯微鏡觀察納米粒的微觀形態(tài)；馬爾文粒徑儀及Zeta電位分析儀檢測其粒徑及電位；紫外分光光度計記錄IR-820的吸收光譜并以最高吸收峰繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用紫外分光光度計檢測納米粒IR-820包封率及載藥量。納米粒IR-820包封率(%)=(投入IR-820總量－上清液中IR-820量)/投入IR-820總量×100%；載藥量(%)=(投入IR-820總量－上清液中IR-820量)/納米粒總量×100%。

1.3 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外熱致相變及光熱效應(yīng) 納米粒的熱致相變：取適量稀釋100倍的納米粒于載玻片上，用加熱板加熱至不同溫度(25、45、50、55、60 ℃)，倒置顯微鏡(×100)下觀察納米粒的變化情況。納米粒的光熱效應(yīng)：采用808 nm激光(1 W/cm2、5 min)分別輻照不同濃度(31.25、62.5、125、250 μg/ml)納米粒溶液，以PBS為對照，采用熱成像儀監(jiān)測溫度變化。同時為探討納米粒中不同成分的升溫情況，設(shè)置對照組(PBS)、PFP@PLGA組(PLGA濃度為10 mg/ml)、IR-820組(IR-820濃度為250 μg/ml)、IR-820/PFP@PLGA組，采用熱成像儀監(jiān)測各組的溫度變化。

1.4 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外超聲/光聲成像觀察

1.4.1 超聲成像 將PBS、IR-820溶液(IR-820濃度為250 μg/ml)及IR-820/PFP@PLGA納米粒溶液(IR-820濃度為250 μg/ml)分別注入3%瓊脂凝膠模型中，采用超聲診斷儀檢測超聲輻照前后的超聲成像效果，并用DFY組織灰度檢測軟件測量分析灰度值。

1.4.2 光聲成像 將不同濃度(31.25、62.5、125、250、500 μg/ml)IR-820/PFP@PLGA納米粒溶液注于3%瓊脂凝膠模型中，用Vevo LAZR 光聲成像儀檢測激光輻照前后各組的光聲成像效果，并對光聲信號進行定量分析。

1.5 IR-820/PFP@PLGA納米?；钚匝跎赡芰z測 將含50×10-6SOSG的不同濃度(0、31.25、62.5、125、250 μg/ml)IR-820/PFP@PLGA納米粒的3 ml溶液加入10 ml EP管內(nèi)，并用1.0 W/cm2的激光輻照3 min，采用熒光分光光度計檢測其熒光值(激發(fā)波長504 nm，發(fā)射波長525 nm)；為探索納米粒產(chǎn)生活性氧的含量與激光輻照時間是否具有相關(guān)性，將含有50×10-6SOSG的濃度為250 μg/ml的IR-820/PFP@PLGA納米粒用1.0 W/cm2的激光輻照不同時間(0、30、60、90、120、150 s)，采用熒光分光光度計記錄其熒光值。

1.6 IR-820/PFP@PLGA納米粒對FLSs活性的影響MH7A FLSs用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，所有實驗均使用對數(shù)生長期細胞。將MH7A細胞于96孔板鋪板(1×104個/孔)，設(shè)置對照組(PBS)及不同濃度納米粒組(31.25、62.5、125、250 μg/ml)。細胞孵育至貼壁后換成100 μl含有不同濃度納米粒的新鮮培養(yǎng)液(n=5)繼續(xù)孵育24 h，加入含有10% CCK-8的無血清培養(yǎng)液孵育4 h，采用酶標(biāo)儀記錄450 nm波長處的的吸光度，并進行統(tǒng)計分析。

1.7 激光介導(dǎo)的IR-820/PFP@PLGA納米粒對FLSs的光動力治療作用 納米粒光動力作用對細胞活性的影響采用CCK-8法檢測。除加入不同納米粒進行激光輻照(1 W/cm2，90 s)處理外，其余過程與1.6相同。通過對納米粒體外熱效應(yīng)及活性氧生成能力的分析，最終實驗選用納米粒濃度250 μg/ml、激光(1 W/cm2)輻照90 s的條件進行光動力治療。將MH7A細胞接種于12孔板，實驗分為四組(n=3)：(1)對照組；(2)單純激光組；(3)IR-820/PFP@PLGA納米粒組(濃度為250 μg/ml；(4)IR-820/PFP@PLGA納米粒(濃度為250 μg/ml)+激光組。待細胞貼壁后，加入PBS或納米粒共孵育24 h，用PBS沖洗未結(jié)合的納米粒，加入等量新鮮培養(yǎng)液后進行激光輻照(1 W/cm2，90 s)，孵育24 h后收集細胞，Annexin V-FITC/PI雙染5 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad 8軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IR-820/PFP@PLGA納米粒的基本特征 IR-820/PFP@PLGA納米粒液肉眼呈墨綠色乳液，光鏡下可見納米粒大小均勻、分散性較好(圖1A)，透射電鏡可見納米粒呈類圓形黑色球體(圖1B)。馬爾文粒徑儀檢測結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA納米粒粒徑為(261.8±3.2) nm(圖1C)，電位為(-27.4±0.7) mV；紫外分光光度計見IR-820在680 nm處具有明顯的吸收峰，通過不同濃度的IR-820溶液在680 nm處的吸光度，繪制IR-820的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.068X+0.029，R2=0.997(圖1D、E)。并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出納米粒IR-820的包封率為72.15%±0.43%，載藥量為7.61%±0.63%。

圖1 IR-820/PFP@PLGA納米粒的基本特征Fig.1 Basic characterization of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles

2.2 IR-820/PFP@PLGA納米粒的熱致相變及光熱效應(yīng) 光鏡觀察到常溫(25 ℃)時納米粒溶液呈均勻的點狀納米顆粒，隨著溶液溫度上升，可見納米顆粒逐漸變成納米微泡，即納米粒包載的PFP發(fā)生熱致相變(圖2A)。通過熱紅外成像儀記錄用808 nm激光輻照的不同濃度納米粒，可見經(jīng)激光輻照后納米粒溶液的溫度隨其濃度增高而增加，溶液溫度最高可達到50 ℃以上，說明體外激光輻照能激發(fā)納米粒發(fā)生液氣相變(PFP相變29 ℃左右，圖2B)。熱紅外成像結(jié)果顯示，IR-820組、IR-820/PFP@PLGA組激光輻照后溶液出現(xiàn)類似溫度升高，從側(cè)面證實納米粒成功包載了IR-820(圖2C)。

圖2 IR-820/PFP@PLGA納米粒熱相變及光熱效應(yīng)觀察(n=3)Fig.2 Thermal phase transition and photothermal effect of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles (n=3)

2.3 IR-820/PFP@PLGA納米粒體外超聲/光聲雙模態(tài)成像 超聲診斷儀成像顯示，對照組、IR-820溶液組及IR-820/PFP@PLGA組在激光輻照前的超聲及造影模式均呈低回聲信號。激光輻照后，對照組、IR-820溶液組的超聲和造影模式圖像仍呈低回聲信號，僅IR-820/PFP@PLGA納米粒的超聲和造影模式圖像回聲信號明顯增強，DFY軟件定量測量顯示了相同的結(jié)果(圖3A-C)。同時，光聲成像儀可觀察到納米粒的光聲信號隨納米粒的濃度升高而增強，定量分析顯示兩者呈線性關(guān)系(圖3D)。

圖3 體外IR-820/PFP@PLGA納米粒超聲/光聲成像觀察(n=3)Fig.3 Ultrasound/photoacoustic imaging of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles in vitro (n=3)

2.4 IR-820/PFP@PLGA納米粒的活性氧生成能力檢測結(jié)果 已知SOSG在體外與活性氧結(jié)合會生成SOSG-EP，表現(xiàn)為熒光強度值增加。激光輻照后，SOSG的熒光值隨納米粒濃度升高而增加(P<0.05，圖4A)。同時，當(dāng)納米粒濃度固定時(如250 μg/ml)，SOSG的熒光值隨激光輻照時間延長而增加(圖4B)。

圖4 IR-820/PFP@PLGA納米?；钚匝跎赡芰z測結(jié)果(n=3)Fig.4 Reactive oxygen species of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles (n=3)

2.5 IR-820/PFP@PLGA納米粒對FLSs活性的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度(31.25、62.5、125、250 μg/ml)納米粒作用24 h后FLSs的細胞活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5A)。

2.6 激光介導(dǎo)IR-820/PFP@PLGA納米粒對FLSs光動力治療作用觀察 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)激光輻照后，F(xiàn)LSs的細胞活性隨納米粒濃度升高呈下降趨勢，當(dāng)納米粒濃度為250 μg/ml時，細胞活性約為對照組的55%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA+激光組細胞凋亡率為40.66%，而對照組、單純激光組和IR-820/PFP@PLGA組均未見明顯的細胞凋亡(圖5C)。

圖5 IR-820/PFP@PLGA納米粒的光動力治療結(jié)果Fig.5 The photodynamic therapeutic effect of IR-820/PFP@PLGA nanoparticles

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理改變主要為受累關(guān)節(jié)滑膜組織增殖及炎癥破壞，其治療目標(biāo)為阻斷或延緩滑膜炎癥增生的病理生理過程[12-14]。RA病程進展的主要原因是具有類似腫瘤細胞的高增殖率、侵襲、遷移及抗凋亡特征的FLSs[15]過度增殖，因此早期監(jiān)測及干預(yù)FLSs的異常增殖對緩解甚至治愈RA具有重要意義。IR-820為吲哚菁綠的類似物，被稱為新吲哚菁綠，具有良好的光聲成像、光熱效應(yīng)及光動力效應(yīng)，可用于疾病的光聲成像診斷及PDT治療研究。同時，PFP(沸點為29 ℃)可隨溫度升高由液態(tài)相變?yōu)闅鈶B(tài)，是近年來超聲造影劑研究的重點，被大量用于增強超聲成像研究。光動力治療[16]的原理是某種光敏劑在特定波長的激光輻照后產(chǎn)生活性氧，可殺傷FLSs細胞，進而促進FLSs的凋亡。但由于目前RA的影像學(xué)診斷方式主要以單一成像模式為主，對早期病變的診斷準(zhǔn)確性不高，因此，探索多模態(tài)分子成像[17]對診斷RA具有重要意義。

本研究制備的I R-8 2 0/P F P@P LG A 納米粒具有光熱效應(yīng)及光動力效應(yīng)，且能夠增強超聲成像和光聲成像能力，對RA體外模型中的FLSs細胞具有光動力殺傷作用。本研究結(jié)果顯示，IR-820/PFP@PLGA納米粒在溶液中呈墨綠色，大小均一，形態(tài)規(guī)則，粒徑為(261.8±3.2) nm，電位為(-27.4±0.7) mV；納米粒IR-820包封率為72.15%±0.43%，載藥量為7.61%±0.63%。體外熱致相變實驗發(fā)現(xiàn)，納米粒顆粒可隨外界溫度升高而發(fā)生液氣相變，體積逐漸增大；同時，體外光熱效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，納米粒濃度為250 μg/ml、激光輻照約100 s，納米粒溫度可達到50 ℃并維持5 min，足以使納米粒包載的PFP熱致相變，呈現(xiàn)增強超聲成像能力，可用于疾病的光熱治療。雖然RA滑膜炎病變類似于腫瘤，但考慮到滑膜異常增生及炎癥激活表型的滑膜組織與周圍正常組織邊界不太清晰，以及光熱效應(yīng)[18]可能對周圍正常組織細胞活性產(chǎn)生不利影響，本研究通過控制激光輻照時間盡量降低納米粒的光熱效應(yīng)。體外活性氧生成實驗結(jié)果顯示，納米?；钚匝跎闪颗c納米粒濃度及激光輻照時間呈正相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)納米粒濃度為250 μg/ml時，激光輻照3 min的熒光值稍高于輻照5 min的熒光值，這可能與熒光淬滅有關(guān)。

通過納米粒體外雙模態(tài)成像和光動力治療研究發(fā)現(xiàn)，激光輻照后納米粒光聲成像效果與其濃度呈線性關(guān)系，納米粒的B型超聲、增強超聲成像效果較對照組及輻照前明顯增強。納米粒FLSs細胞活性實驗發(fā)現(xiàn)，單純納米粒與FLSs細胞孵育24 h后，實驗組細胞活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該納米粒在體外對滑膜細胞具有較高的生物安全性，可用于后續(xù)實驗。然而，納米粒組經(jīng)激光輻照90 s后細胞活性呈下降趨勢，當(dāng)納米粒濃度為250 μg/ml時，細胞活性已降低至55%。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，激光介導(dǎo)納米粒組的細胞凋亡率達40.66%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，本研究采用雙乳化法成功制備出包載PFP[19]和IR820[20]的PLGA納米粒(IR820/PFP@PLGA)，在激光輻照后可使局部溫度升高，從而增強超聲成像能力，同時激光與IR820作用可產(chǎn)生具有殺傷作用的活性氧，促進FLSs細胞的凋亡。但若想將該納米粒應(yīng)用于臨床仍然面臨諸多問題。首先是納米粒在體內(nèi)的安全性，如是否會在體內(nèi)聚集形成栓塞或者引起肝腎衰竭等；其次是納米粒的靶向性，該實驗設(shè)計的納米粒表面未連接相關(guān)配體[21]，即使應(yīng)用到體內(nèi)也主要是利用局部病理組織的高滲透長滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)[22]，缺乏靶向特異性。因此，在后續(xù)的研究中可探索將相應(yīng)的配體連接到納米粒表面，以提高納米粒的靶向特異性，并確保其良好的體內(nèi)生物安全性，為RA的診療提供新的思路。