岳文杰，金心怡，陳明杰，葉乃興，郭麗，趙峰

基于非靶向代謝組學分析白茶室內(nèi)自然萎凋過程代謝物的變化規(guī)律

岳文杰1,2,3，金心怡2*，陳明杰4*，葉乃興2，郭麗5，趙峰6

1.福建農(nóng)林大學金山學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學園藝植物生物學及代謝組學研究中心，福建 福州 350002；4.信陽師范學院生命科學學院及河南省茶樹生物學重點實驗室，河南 信陽 464000；5.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；6.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122

以福安大白茶品種鮮葉為材料，按照室內(nèi)自然萎凋工藝加工白茶，每隔3?h采集過程樣，利用非靶向代謝組學技術(shù)分析了代謝物的含量變化。結(jié)果表明，在白茶室內(nèi)自然萎凋過程中，茶鮮葉中的代謝物含量呈現(xiàn)規(guī)律性的動態(tài)變化。研究共鑒定到106種代謝物，其含量呈現(xiàn)5種主要變化趨勢。這些變化趨勢可以分為4個階段，分別為萎凋前24?h、萎凋24～48?h、萎凋48～57?h、萎凋57?h之后。這些差異代謝物按照結(jié)構(gòu)分為4種類型：類黃酮化合物中8種單體兒茶素（Catechins）在萎凋過程中呈現(xiàn)下降趨勢；18種原花青素物質(zhì)（PAs）和5種聚酯型兒茶素（TSs）有升有降；含沒食子?；腜As與TSs含量均呈現(xiàn)上升趨勢，而未含該基團的兩類物質(zhì)含量則呈現(xiàn)下降趨勢。糖苷衍生物中6種山奈酚（Kaempferol）糖苷，4種槲皮素（Quercetin）糖苷，1種芹菜素（Apigenin）糖苷含量均呈上升趨勢，且在萎凋48?h后含量明顯上升。在萎凋過程中12種酚酸類物質(zhì)中5種呈現(xiàn)上升趨勢，7種呈現(xiàn)下降趨勢，這些物質(zhì)均在萎凋至57～60?h時出現(xiàn)最高或最低值。此外，分析了生物堿、氨基酸與多肽、香豆素類、糖等20種代謝物的含量變化，其中咖啡堿含量呈現(xiàn)上升趨勢，在萎凋60?h時最高，可可堿含量在萎凋中期下降明顯，萎凋后期略有回升，2種茶氨酸異構(gòu)體和4種香豆素物質(zhì)含量在萎凋至12?h達到峰值，此后總體呈下降趨勢。本研究為明確白茶在自然萎凋加工過程中的生物代謝調(diào)控機制提供重要參考。

白茶；自然萎凋；非靶向代謝組學；代謝物

白茶為我國傳統(tǒng)六大茶類之一，主產(chǎn)于福建福鼎、政和、建陽、松溪等地，是福建省特有茶類。與綠茶、紅茶、烏龍茶等茶類的加工工藝不同，白茶在加工過程中不炒不揉，特別是茶葉鮮葉經(jīng)歷了長時間的萎凋，期間緩慢的發(fā)酵（氧化）賦予了白茶獨特的香氣與滋味[1-3]，并形成了抗自由基活性、保護神經(jīng)、提高體外抗癌活性、抑制沙門氏菌等多種保健功效[4-14]。室內(nèi)自然萎凋是常見的白茶萎凋方式之一，相較于加溫萎凋與復式萎凋，其萎凋時間更長，使茶鮮葉表面水分散失和葉細胞濃度改變更為緩慢，從而減緩了鮮葉主要生化成分的變化，有利于白茶特有香氣和滋味的形成。已有研究表明，在白茶萎凋過程中，茶多酚總量、EC、EGC和EGCG等兒茶素組分含量呈現(xiàn)“先升高后降低”的趨勢[15-16]，與兒茶素合成相關(guān)的關(guān)鍵基因也出現(xiàn)下調(diào)[17-18]，3-甲基-ECG、3-甲基-EGCG含量則在萎凋前期較鮮葉大幅提升，茶黃素、茶黃素3-沒食子酸酯、聚酯型兒茶素A、聚酯型兒茶素B等含量也有提升[19]，咖啡酸、沒食子酸、檸檬酸等酚酸物質(zhì)呈遞增趨勢，而香豆酸、綠原酸、奎寧酸、茶沒食子素、沒食子酰葡萄糖苷1、沒食子酰葡萄糖苷2等呈遞減趨勢[20]；生物堿中的咖啡堿含量升高，可可堿含量下降，而由于核糖核酸的降解，()-5'-脫氧-5'-(甲基亞磺酰基)腺苷、5'-甲硫腺苷、腺苷、腺嘌呤核苷酸和鳥苷等多種核苷（酸）含量也顯著上升；此外，蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)，在白茶萎凋過程中會出現(xiàn)多種蛋白質(zhì)降解、大部分游離氨基酸含量提升、茶氨酸含量下降的現(xiàn)象[21-22]。而白茶風味也隨之發(fā)生變化。當萎凋減重率＞20%時，風味物質(zhì)開始產(chǎn)生；萎凋減重率達40%之后形成較快；萎凋減重率≥60%時，白茶風味在香氣、滋味方面均表現(xiàn)明顯[23]。

隨著對白茶萎凋過程中不同代謝物含量變化研究的開展，特別是以高通量、高靈敏度為特點的新興非靶向代謝組學技術(shù)在茶葉領(lǐng)域的應用，為解析白茶代謝物在萎凋過程中的變化提供了先進的研究手段。為了進一步了解白茶在自然萎凋過程中代謝物的變化規(guī)律，本研究以福安大白茶品種鮮葉為試驗材料，按照室內(nèi)自然萎凋工藝加工白茶，采用UPLC-QTOF MS結(jié)合多變量分析方法，通過獲取代謝物的豐度信息，分析白茶在室內(nèi)自然萎凋過程的代謝物變化，發(fā)掘在萎凋過程中的主要差異代謝物及其動態(tài)變化規(guī)律，以期為白茶加工技術(shù)提供理論依據(jù)，并為進一步明確白茶在自然萎凋加工過程中的生物合成與調(diào)控機制提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用福安大白茶品種為試驗材料，福建省南平市政和瑞茗茶葉有限公司提供，于2016年5月25日采摘一芽三四葉，室內(nèi)自然萎凋工藝制備白茶茶樣，萎凋室內(nèi)環(huán)境溫濕度分別為(26.6±1.4)℃、(88.9±3.4)%，萎凋60?h，用鏈板式烘干機于120℃烘20?min，得烘干樣待用。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇、甲酸購自德國默克公司；乙酸購自美國天地公司；去離子水由Milli-Q凈水系統(tǒng)制備；所有化學試劑均為色譜純級。

標準品信息：原花青素B1（Procyanidin B1）、原花青素B2（Procyanidin B2）、原花青素B3（Procyanidin B3）、原花青素A1（Procyanidin A1）、原花青素A2（Procyanidin A2）等購自中國Chemface公司；沒食子酸（Gallic acid）、綠原酸（Chlorogenic acid）、兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，CG）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin3--gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、槲皮素、山奈酚、咖啡酸（Caffeic acid）等購自美國Sigma公司；可可堿（Theobromine）購自中國西力公司。

5430R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；KQ-300GDV型恒溫數(shù)控超聲波萃取設備（中國昆山市超聲儀器有限公司）；G560E Vortex-Genie渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；SYNAPT G2-Si HDMS超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集方法及標記

在白茶室內(nèi)自然萎凋過程中，每隔3?h取一次過程樣，為確保樣品真實反映代謝物含量變化，取樣時選取10個完整的一芽三、四葉樣品為一組，用錫箔紙包裹后置于液氮中保存，每個過程樣取3個重復，取樣完成后迅速凍干處理，保存于–80℃超低溫冰箱。樣品標記為：F（鮮葉），N1—N21（萎凋過程樣與烘干樣）。

1.3.2 茶樣檢測的前處理方法

將茶樣研磨成粉后稱取(10±0.5)mg，添加200?μL 80%甲醇（色譜級）后進行超聲萃?。ǔ晽l件：25℃，30?min），后于常溫下12?000離心3?min，取上清液至1.5?mL離心管中；重復添加甲醇、超聲萃取、離心步驟2次，合并上清液；添加200?μL 80%甲醇（色譜級）、0.1%甲酸（/）繼續(xù)超聲萃取、離心，并重復該步驟1次，合并上清液；上清液通過0.2?μm孔徑過濾器過濾，上機檢測前對濾液稀釋50倍后進樣。

1.3.3 質(zhì)量控制樣（QC sample）的制備

將研磨成粉的全部樣品，各稱取105～110?mg充分混勻后，稱取150?mg置于離心管中，按照上述茶樣前處理步驟（保持濃度一致）進行提取制備后供上機檢測，標記為QC。

1.3.4 空白對照樣（Blank sample）的制備

按照茶樣的前處理方法，在不加入樣品只添加相應等量試劑的情況下，采取同樣條件提取制備后供上機檢測，標記為Blank。

1.3.5 超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜參數(shù)設定

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 column（100?mm×2.1?mm，1.8?μm，英國Waters公司）。

流動相條件：A為5%（/）乙腈水溶液，B為含0.1%（/）甲酸的乙腈溶液。

線性梯度洗脫條件：起始0?min，0% B；2?min時7% B；13?min時B達到40%；14?min時，B達到100%；17?min時，B恢復到0%。

進樣參數(shù)：分析時間20?min，連續(xù)進樣間隔4?min；進樣體積1?μL；流速為0.3?mL·min-1。其他參數(shù)設定：采取ESI(+/-)電離方式，毛細管電壓±2.0?kV，離子源溫度120℃，進樣錐氣體流速為50?L·h-1，脫氣流速為800?L·h-1，電子轟擊能量10～40?eV，m/z掃描范圍為0～1?200?Da的全掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)采集與處理方法

1.4.1 數(shù)據(jù)采集方法

每個樣品分別以正負兩種離子模式（ESI+和ESI-）掃描獲得兩組數(shù)據(jù)，質(zhì)量控制樣（QC）在運行過程中每隔10個樣品注射1次，以監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性。設備通過MassLynx 4.1（美國Waters公司）軟件進行操作。

采集完畢的原始數(shù)據(jù)導入Progenesis QI（v2.1，Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK）軟件開展峰對齊-峰采集-去卷積化等處理，獲取包含質(zhì)荷比（m/z）、保留時間及物質(zhì)峰面積等信息的數(shù)據(jù)表格。數(shù)據(jù)表格利用空白對照樣清除污染，質(zhì)量控制樣計算相對標準偏差（RSD），去除RSD超過30%的不可靠物質(zhì)信息，并校正各茶樣質(zhì)量（精確至1?mg），計算獲取各過程樣3個重復的平均值后開展數(shù)據(jù)分析。

1.4.2 代謝產(chǎn)物的鑒定

代謝產(chǎn)物根據(jù)精確分子量、MS/MS二級碎片信息、購買的化合物標準品，通過在線搜索HMDB（http://www.hmdb.ca）、ChemSpider（http://www.chemspider.com）和Metlin（metlin.scripps.edu）等數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)參考文獻進行物質(zhì)鑒定。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

采用SIMCA-P+14.1軟件進行主成分分析（PCA），采用MultiExperiment Viewer 4.9.0（MeV）軟件進行熱圖分析（Heat-map）。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。采用Excel 2016軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物主成分分析

對兩種不同離子模式下（正、負離子）采集的數(shù)據(jù)進行處理，分別得到1?067種和883種代謝物。為了更加直觀地揭示自然萎凋加工過程中白茶代謝物的變化，采用PCA探索不同萎凋時間樣品間的相關(guān)性。結(jié)果表明，在負離子模式下，由22個茶樣（鮮葉F、萎凋過程樣與烘干樣），883個代謝物組成的主成分分析模型中，第一和第二主成分分別解釋了總方差的72.0%和12.6%，表明模型可靠。在PCA的得分圖（Score plot）上，22個茶樣隨著萎凋時間的推移，呈現(xiàn)沿第一主成分負方向發(fā)展的基本規(guī)律，表明在室內(nèi)自然萎凋加工過程中，茶葉鮮葉中的代謝物含量在發(fā)生緩慢的變化。其中在白茶萎凋的前24?h內(nèi)，茶樣在得分圖上基本聚集在一起，表明相較于其他茶樣，萎凋前24?h的8個茶樣（含鮮葉）中的代謝物組成具有更高的相似性。此外，在第一主成分坐標系中，還形成了萎凋前24?h、24～48?h、48～57?h、57?h之后等4個相似性較一致的區(qū)域（圖1-A）。正離子模式下的主成分分析得分圖（第一和第二主成分分別解釋了總方差的71.0%和11.9%）也呈現(xiàn)與負離子相似的規(guī)律，22個茶樣隨著萎凋時間的推移，呈現(xiàn)沿第一主成分正方向發(fā)展，但不同萎凋時間茶樣在得分圖上聚集的規(guī)律不明顯，萎凋前39?h代謝物組成具有更高的相似性（圖1-B）。

2.2 差異代謝物的篩選、鑒定與總體變化的熱圖分析（Heat-map）

利用SPSS軟件，以正、負兩種離子模式下的1?067個和883個代謝物的響應強度（峰面積）為指標，進行單因素方差分析，以獲得每個代謝物的值，并以<0.05（Bonferroni校正）篩選白茶室內(nèi)自然萎凋過程中的差異代謝物，進行物質(zhì)鑒定，在正、負離子模式下共鑒定到差異代謝物106個，這些差異代謝物在萎凋過程中的變化規(guī)律如圖2所示。

在室內(nèi)自然萎凋過程中，106個主要差異代謝物含量的變化趨勢主要分為5種類型：第一類呈現(xiàn)“低→高→低”的變化趨勢，這類代謝物在萎凋前期的含量較低，而隨著萎凋的進行，24?h后含量開始上升，至48?h的含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢；第二類呈現(xiàn)“高→較低→低”的變化趨勢，在萎凋前期的含量最高，而隨著萎凋的進行，含量不斷下降，特別是萎凋至24?h時，含量出現(xiàn)比較明顯的下降趨勢；第三類呈現(xiàn)“高→較高→低”的變化趨勢，這類代謝物在萎凋前48?h均保持較高含量，而在萎凋后期，其含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢；第四類呈現(xiàn)“低→較高→高”的變化趨勢，這類代謝物在萎凋前期的含量低，而萎凋至24?h時含量明顯上升，直至萎凋結(jié)束；第五類呈現(xiàn)“低→較低→高”的變化趨勢，這類代謝物萎凋至48?h，含量才明顯上升，直至萎凋結(jié)束。

2.3 不同類別差異代謝物含量變化分析

2.3.1 兒茶素及其聚合物在萎凋過程的含量變化

7種鑒定到的單體兒茶素：Catechin（C）、Epicatechin（EC）、Gallocatechin（GC）、Epigallocatechin（EGC）、Catechin gallate（CG）、Epicatechin3--gallate（ECG）、Epigallocatechin gallate（EGCG）在萎凋過程中含量均呈現(xiàn)下降的趨勢，且均在萎凋至48?h后含量大幅降低。其中EGCG在萎凋中前期保持較高含量，萎凋至48?h時含量迅速下降直至萎凋結(jié)束；EGC在萎凋24?h時，開始出現(xiàn)大幅下降的趨勢，在萎凋27?h之后回升，至48?h含量持續(xù)下降。與鮮葉相比，C、GC、EC、EGC的含量分別下降70.01%、84.63%（ESI-）、77.46%（ESI+）和91.08%，3種酯型兒茶素CG、ECG、EGCG的含量分別下降94.51%、23.60%和60.66%。甲基化兒茶素3-甲基-EGCG [Epigallocatechin 3-(methyl-gallate)]含量與其他單體兒茶素規(guī)律一致，呈現(xiàn)下降趨勢，含量最高下降67.06%，4-甲基-ECG [Epicatechin 3--(4-methylgallate)]則在萎凋中期開始上升，至萎凋48?h時含量最高，相比鮮葉升高90.65%（圖3）。

注：A：負離子模式； B：正離子模式；F：鮮葉；N：室內(nèi)自然萎凋茶樣（N1—N20依次為萎凋3?h、6?h……60?h過程樣，N21為63?h為烘干樣）

Note: A: negative ion mode, B: positive ion mode, F: fresh leaves, N: indoor withering white tea samples, N1: 3?h withering sample, N2: 6??h withering sample, ……, N20: 60?h withering sample.N21: 63?h drying sample

圖1 室內(nèi)自然萎凋白茶的主成分得分圖

Fig.1 The principal component score plot analysis (PCA) of indoor withering white tea

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物，下同

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode.The same below

圖2 白茶室內(nèi)自然萎凋過程代謝物變化熱圖（Heat-map）

Fig.2 The heat-map of indoor withering white tea

在白茶的萎凋過程中，茶樣中的原花青素類物質(zhì)含量主要呈現(xiàn)兩種變化趨勢，11種物質(zhì)在制茶過程中含量上升，其中3,3'-雙沒食子酰基原花青素B2（3,3'-Digalloylprocyanidin B2）、3,3'-雙沒食子?；w燕草素B5（3,3'---galloylprodelphinidin B5）、表阿夫兒茶素-表兒茶素雙沒食子酸酯（Epiafzelechin-epicatechin 3,3'-digallate）、表兒茶素沒食子酸酯-(4->6)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[Epicatechin 3--gallate-(4->6)-epigallocatechin 3--gallate，ECG-(4->6)-EGCG]、表兒茶素沒食子酸酯-(4->8)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[Epicatechin 3--gallate-(4->8)-epigallocatechin3--gallate，ECG-(4->8)-EGCG]、表兒茶素-沒食子兒茶素[Epicatechin-(4->8)-gallocatechin，EC-GC]、表沒食子兒茶素-兒茶素[Epigallocatechin-(4->8)-catechin，EGC-C]、原飛燕草素A沒食子酸酯（Prodelphinidin A-2 3'--gallate）、表兒茶素-表兒茶素-表兒茶素[Epicatechin-(4->6)-epicatechin-(2->7,4->8)-epicatechin，EC-EC-EC]等物質(zhì)相較于鮮葉含量分別提升47.23%、54?565.06%、36.15%、595.47%、2?472.51%、80.40%、105.39%、3?631.26%和1?546.93%，而3'-沒食子?；w燕草素B2（3'-Galloylprodelphinidin B2）、原花青素A2（Procyanidin A2）等2種物質(zhì)在鮮葉中未檢出，萎凋則促進了他們含量的大幅度提升。從萎凋時間上看，原飛燕草素A沒食子酸酯、原花青素A2等含量在萎凋前24?h上升速率明顯提升，而ECG-(4->8)-EGCG、3,3'-雙沒食子?；w燕草素B5、ECG-(4->6)-EGCG、3'-沒食子酰基原飛燕草素B2等物質(zhì)含量在萎凋至45?h時開始大幅提升。而原花青素B1、B2、B3、C1、兩種原飛燕草素B異構(gòu)體、原花青素三聚體等7種物質(zhì)則呈現(xiàn)下降趨勢，其中兩種原花青素B異構(gòu)體含量在萎凋至18?h時大幅下降，至萎凋48?h后逐漸下降至儀器檢出線以下。研究發(fā)現(xiàn)，含沒食子?；脑ㄇ嗨仡愇镔|(zhì)含量均呈現(xiàn)上升趨勢，而由表兒茶素與表沒食子兒茶素聚合形成的原花青素類和原飛燕草素類物質(zhì)則均呈下降趨勢（圖4）。

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

圖3 白茶室內(nèi)自然萎凋過程樣的單體兒茶素類物質(zhì)變化

Fig.3 The changes of catechins in indoor withering white tea

鑒定到的4種聚酯型兒茶素（TSs）中，聚酯型兒茶素A、B、F（Theasinensin A、B、F）等3種物質(zhì)含量在萎凋過程中呈上升趨勢，聚酯型兒茶素A含量在萎凋至60?h時較鮮葉提升8?983.37%，聚酯型兒茶素B和聚酯型兒茶素F則分別提升6?672.05%和242.05%，聚酯型兒茶素C含量則呈下降趨勢，至萎凋57?h后下降到儀器檢出線以下（圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，含量上升的聚酯型兒茶素A、B、F均含有沒食子酰基，而含量下降的聚酯型兒茶素C不含該基團，這種規(guī)律與上述原花青素物質(zhì)含量變化規(guī)律一致。

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

圖4 白茶室內(nèi)自然萎凋過程樣的原花青素類與聚酯型兒茶素物質(zhì)變化

Fig.4 The changes of PAs and TSs in indoor withering white tea

2.3.2 黃酮及其糖苷在萎凋過程的含量變化

在室內(nèi)自然萎凋白茶加工過程樣中共鑒定到21種黃酮及其糖苷物質(zhì)。其中6種山奈酚糖苷：（山奈酚3--半乳糖苷Kaempferol 3----galactopyranoside，+65.54%）、山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷（Kaempferol-3--galactosyl-rhamnosyl-glucoside，+88.57%）、山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷（Kaempferol-3--glucosyl-rhamnosyl-glucoside，+55.03%）、山奈酚3--新橙皮糖苷/山奈酚-4′′--牡荊素葡萄糖苷（Kaempferol-3--neohesperidoside/Kaempferol-4′′--glucosylvitexin，+415.20%）、山奈酚-3--蕓香糖苷（Kaempferol-3--rutinoside，+62.58%）、山奈酚-3--吡喃葡萄糖苷（Kaempferol-3----glucopyranoside，+28.18%）；4種槲皮素糖苷：槲皮素2-沒食子酰葡萄糖苷（Quercetin 3-(2-galloylglucoside)，+166.22%）、槲皮素3--半乳糖基-蕓香糖苷（Quercetin 3--galactosyl-rutinoside，+96.51%）、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷（Quercetin-3--[--glucopyranosyl-(1→3)---rhamnopyranosyl-(1→6)---galactopyranoside]，+116.14%）、槲皮素3--葡萄糖基-鼠李糖基-香豆酰己糖苷[Quercetin-3--glucosyl-rhamnosyl-(-coumaroyl)hexoside），+17.83%]；1種芹菜素糖苷：芹菜素6--葡萄糖基8--阿拉伯糖苷（Apigenin 6--glucoside 8--arabinoside，+350.79%）。它們在萎凋過程中含量變化出現(xiàn)較為一致的規(guī)律，均在萎凋后期，特別是萎凋48?h后開始不斷升高。這11種糖苷物質(zhì)中，信號強度最高（峰面積）的3種物質(zhì)是山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷和山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷（圖5）。

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

圖5 室內(nèi)自然萎凋白茶過程樣的黃酮及其糖苷物質(zhì)變化

Fig.5 The changes of flavonoids and glycosides in indoor withering white tea

2.3.3 酚酸類物質(zhì)在萎凋過程的含量變化

在白茶萎凋過程鑒定到的18種具有差異性的酚酸類物質(zhì)中，2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯（Methyl 2,4,6-trihydroxybenzoate）、沒食子酸、5--反式香豆酰基奎寧酸異構(gòu)體1（5--trans-Coumaroylquinic acid isomer1）、檸檬酸/異檸檬酸（Citric acid/Isocitric acid）、對香豆酸（-coumaric acid）、1-沒食子酰基葡萄糖異構(gòu)體4（1-Galloyl-glucose ISOMER4）等6種物質(zhì)在加工過程中含量提升，萎凋至57～60?h時，其含量達到最大值，與鮮葉比較，這些物質(zhì)的含量分別提升了150.80%、659.81%（ESI-）、54.57%、89.79%、45.59%和688.32%。而茶沒食子素（Theogallin）、()-8-羥基-2-辛烯-4,6-二炔酸[()-8-Hydroxy-2-octene- 4,6-diynoic acid]、4-羥基苯丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvic acid）、對羥基扁桃酸（-Hydroxymandelic acid）、奎寧酸（Quinic acid）、3-羥基苯甲酸（3-Hydroxybenzoic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、水楊酸（Salicylic acid）、綠原酸（Chlorogenic acid）、5-咖啡酰奎寧酸（5-Caffeoylquinic acid）等10種物質(zhì)含量在萎凋過程中呈現(xiàn)下降趨勢，其含量變化與上述6種物質(zhì)相反，且在萎凋后期（57～60?h）含量下降至最低值，較鮮葉含量分別下降54.13%、78.13%、75.46%、74.86%、44.47%、25.95 %、94.26%、92.33%、51.26%和95.85%（圖6）。

2.3.4 其他物質(zhì)在萎凋過程的含量變化

此外，在白茶萎凋過程中還鑒定了20種其他代謝物，主要包括生物堿、氨基酸與多肽、香豆素類、糖類等。如圖7所示，白茶萎凋過程中，咖啡堿（Caffeine）含量提升，但在萎凋前42?h變化不明顯，萎凋60?h時含量達到最大值，相較鮮葉提升達65.78%，烘干使其含量下降14.96%?？煽蓧A在萎凋初期含量較高，隨著萎凋的進行，含量開始下降，且下降速率不斷升高（與鮮葉比較），至萎凋27?h時，下降速率達到最大；此后含量略微回升，至萎凋48?h其含量上升明顯，萎凋54?h出現(xiàn)小幅回落后繼續(xù)上升直至萎凋結(jié)束。2種茶氨酸異構(gòu)體（Theanine isomer）均在萎凋初期上升，至萎凋12?h達到峰值（較鮮葉分別提升89.87%和69.43%）；直至萎凋54?h出現(xiàn)第二個次峰值前，總體呈現(xiàn)下降趨勢；接著繼續(xù)下降直至萎凋結(jié)束。7-Ethoxy-4-methyl-2-1-benzopyran-2-one、Aegelinol、Aesculetin、Umbelliferone等4種香豆素類物質(zhì)也在萎凋12?h時達到峰值（較鮮葉分別提升36.96%、39.39%、20.13%和11.04%），至萎凋60?h時含量降至最低前，總體呈現(xiàn)下降趨勢。

3 討論

3.1 室內(nèi)自然萎凋過程中白茶差異代謝物含量的變化規(guī)律

在白茶室內(nèi)萎凋初期，萎凋葉結(jié)構(gòu)完整，酶促氧化發(fā)揮作用較小，葉內(nèi)主要生化成分變化緩慢，隨著萎凋時間的延長，失水導致葉細胞的細胞膜透性增強，在各種酶的作用下，更多物質(zhì)被氧化，這些物質(zhì)通過聚合、縮合反應，逐步形成雙黃烷醇類、茶黃素和茶褐素等復雜產(chǎn)物[24-25]。在萎凋過程中，單體兒茶素類物質(zhì)含量呈下降趨勢，特別是萎凋后期含量顯著下降，這與陳靜等[17]和王麗麗等[26]的研究結(jié)果一致，Wang等[18]發(fā)現(xiàn)單體兒茶素在萎凋過程中的含量變化與PAL、C4H、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、LAR、ANR等關(guān)鍵酶基因表達水平相關(guān)。此外，沒食子酸在萎凋過程中含量提升，可能是在白茶萎凋后期隨著葉細胞的破裂加劇，葉中的水解單寧酶與含沒食子?；喾咏佑|，催化水解形成EC、EGC等非酯型兒茶素和沒食子酸[27-28]。

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

圖6 室內(nèi)自然萎凋白茶過程樣的酚酸類物質(zhì)變化

Fig.6 The changes of phenolic acids in indoor withering white tea

多種山奈酚、槲皮素、芹菜素等黃酮糖苷物質(zhì)在萎凋過程中，特別是萎凋48?h時含量提升。這類糖苷物質(zhì)在烏龍茶加工過程中，由于經(jīng)歷了高溫處理，導致大部分含量下降[27]，但白茶特殊的加工工藝可能促使更多的兒茶素向黃酮醇糖苷和黃酮糖苷轉(zhuǎn)化，使其保留更多的糖苷物質(zhì)[29]。此外，Zhang等[30]利用LC-MS比較了5種茶屬植物原花青素物質(zhì)含量變化，認為EC葡萄糖苷在原花青素生物合成上起重要作用，可以和EC、EGC等單體兒茶素物質(zhì)合成形成原花青素物質(zhì)，Liu等[31]以豆科模式植物蒺藜苜蓿為研究對象，發(fā)現(xiàn)無色花色素還原酶（LAR）可以使4-(-cysteinyl)-epicatechin轉(zhuǎn)化為EC，EC可以作為啟動單元進一步合成原花青素，4--(-cysteinyl)-epicatechin是原花青素合成的重要底物，而Wang等[32]則進一步證明了在原花青素合成過程中，黃烷-3-醇碳正離子（Flavan-3-ol carbocations）起到重要作用，它可以作為底物與親質(zhì)子的黃烷-3-醇結(jié)合形成低聚或多聚的原花青素物質(zhì)。這些物質(zhì)可能為單體兒茶素提供了合成原花青素物質(zhì)的基礎(chǔ)，促進3,3'-雙沒食子?；ㄇ嗨亍?,3'-雙沒食子?；w燕草素B5、聚酯型兒茶素A、聚酯型兒茶素B、聚酯型兒茶素F等多種原花青素與聚酯型兒茶素的含量在萎凋過程中上升。值得注意的是，這類在萎凋過程中含量上升的物質(zhì)均含沒食子?；?，而未含沒食子?；脑ㄇ嗨谺1、B2、B3、C1、聚酯型兒茶素C等物質(zhì)含量則呈下降趨勢，這與Chen等[33]的研究結(jié)果不同，該研究發(fā)現(xiàn)原花青素B1、B2、B3與聚酯型兒茶素A、聚酯型兒茶素B、聚酯型兒茶素C、聚酯型兒茶素F等均在萎凋過程中含量下降。

注：*表示正離子模式下鑒定到的差異代謝物

Note:* differential metabolites identified in positive ion mode

圖7 白茶室內(nèi)自然萎凋過程的生物堿等5類物質(zhì)變化

Fig.7 The changes of 5 substances in indoor withering white tea hering white tea

在白茶室內(nèi)自然萎凋過程中，沒食子酸、檸檬酸/異檸檬酸、對香豆酸等6種酚酸物質(zhì)含量提升，而茶沒食子素、奎寧酸、咖啡酸、水楊酸、綠原酸等10種物質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢，且均在萎凋57～60?h時達到最大或最小值。這與Marat等[20]對白茶加工過程中有機酸組分含量測定的研究結(jié)果略有不同。本研究中，檸檬酸、沒食子酸、綠原酸在白茶加工過程中的含量變化與Marat等[20]的結(jié)果一致；而咖啡酸、對香豆酸的含量變化結(jié)果相反。此外，咖啡堿含量在萎凋過程中總體上有上升的趨勢，而可可堿含量先下降后升高，但總體含量呈下降趨勢，這與張應根等[23]和Chen等[33]的結(jié)果一致。2種茶氨酸異構(gòu)體的含量變化趨勢也與Chen等[33]的基本一致。

3.2 室內(nèi)自然萎凋工藝對白茶滋味品質(zhì)的影響

室內(nèi)自然萎凋工藝促進了鮮葉中單體兒茶素類物質(zhì)的氧化，導致其含量降低，同時使部分原花青素與聚酯型兒茶素物質(zhì)含量提升，單體兒茶素類含量的下降降低了茶湯的苦澀程度，進一步增加了茶湯的醇度，原花青素的提升則增加了茶葉的保健功效，這些物質(zhì)能夠消除超氧陰離子和羥基自由基，保護脂質(zhì)不發(fā)生過氧化損傷，還可螯合金屬離子，使其在體內(nèi)形成惰性化合物，同時還有助于維生素C的吸收和利用[34]。而多種黃酮糖苷物質(zhì)含量的提升，也促進了白茶滋味的形成，這些物質(zhì)使茶湯口感具有天鵝絨般的柔軟感，雖然豐度遠低于單體兒茶素，但其對滋味貢獻的閾值比兒茶素類物質(zhì)低得多，所以其對改善白茶的口感與滋味有重要貢獻。同時，這些糖苷物質(zhì)還具有很強的抗氧化生物活性，對心血管系統(tǒng)有潛在的益處[35]。此外，沒食子酸、檸檬酸等酚酸物質(zhì)含量在萎凋過程中提升，這些酚酸物質(zhì)是合成酯型兒茶素的前體，隨著酯型兒茶素的水解產(chǎn)生，對茶湯的特有滋味和茶葉品質(zhì)的形成有利，其中含量較高的沒食子素也對茶葉鮮爽滋味有較大貢獻[36]。

3.3 對白茶生產(chǎn)實踐的指導意義

本研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)自然萎凋過程中，白茶的主要代謝物含量變化以萎凋24?h和萎凋48?h為時間節(jié)點，分為萎凋前期（萎凋前24?h）、萎凋中期（萎凋24～48?h）和萎凋后期（萎凋48?h以后）3個階段。在這3個不同的萎凋階段，多種同類型代謝物的含量出現(xiàn)較為一致的規(guī)律，在萎凋前期，單體兒茶素、香豆素、茶氨酸等物質(zhì)含量較高，而原花青素物質(zhì)、聚酯型兒茶素、黃酮糖苷等物質(zhì)則在萎凋后期達到最高含量。研究發(fā)現(xiàn)，4種原花青素物質(zhì)[ECG- (4->8)-EGCG、ECG-(4->6)-EGCG、3'-沒食子?；w燕草素B2和3,3'-雙沒食子酰基原飛燕草素B5]、6種山奈酚糖苷（山奈酚3--半乳糖苷、山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷、山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷、山奈酚3--新橙皮糖苷/山奈酚-4′′--牡荊素葡萄糖苷、山奈酚-3--蕓香糖苷、山奈酚-3--吡喃葡萄糖苷），4種槲皮素糖苷（槲皮素2-沒食子酰葡萄糖苷、槲皮素3--半乳糖基-蕓香糖苷、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷、槲皮素3--葡萄糖基-鼠李糖基-香豆酰己糖苷），1種芹菜素糖苷（芹菜素6--葡萄糖基8--阿拉伯糖苷）的含量均在萎凋45～48?h時開始大幅提升，57～60?h時含量達到最大值；2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、沒食子酸、5--反式香豆?；鼘幩岙悩?gòu)體1、檸檬酸/異檸檬酸、對香豆酸、1-沒食子?；咸烟钱悩?gòu)體4等6種酚酸類物質(zhì)，聚酯型兒茶素A、聚酯型兒茶素B、聚酯型兒茶素F等3種聚酯型兒茶素和咖啡堿等均在萎凋57～60?h時含量達到最大值。張應根等[23]發(fā)現(xiàn)在白茶萎凋過程中滋味的形成一直延續(xù)到萎凋結(jié)束，而上述物質(zhì)的含量也均在萎凋末期的達到最大，這些物質(zhì)對于白茶風味的形成可能具有重要價值。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，4種香豆素類物質(zhì)和2種茶氨酸異構(gòu)體（茶氨酸異構(gòu)體1、2）的含量均在萎凋12?h時達到峰值。這些對于白茶滋味風味在萎凋過程中的變化起到重要作用。本研究結(jié)果明確了白茶加工過程中萎凋時間與品質(zhì)的關(guān)系提供了理論依據(jù)，同時也可以為生產(chǎn)某些高含量成分的白茶產(chǎn)品提供技術(shù)參考，對白茶的生產(chǎn)實踐具有一定的指導意義。

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Analysis of Metabolite Changes in the Natural Withering Process of Fu′an White Tea Based on Non-targeted Metabolomics Approach

YUE Wenjie1,2,3, JIN Xinyi2*, CHEN Mingjie4*, YE Naixing2, GUO Li5, ZHAO Feng6

1.Jinshan College, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3.FAFU-UCR Joint Center/Horticultural Plant Biology and Metabolomics Center, Haixia Institute of Science and Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4.College of Life Sciences, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China; 5.Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 6.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

In this study,cv Fu'an Dabai was used as materials to make white tea following the standard indoor natural withering procedure.Samples were collected every 3?h, and non-targeted metabolomics was used to analyze tea metabolite changes.Principal component analysis (PCA) shows that metabolite contents in fresh leaves showed regular dynamic changes during the process of indoor natural withering of white tea.Totally 109 metabolites with significant difference were identified and showed 5 major patterns.These patterns could be divided into four stages: 24?h before withering, 24-48?h during withering, 48-57?h during withering and after 57?h.According to their structure, these metabolites can be classified into 4 types.The 8 monomer catechins (Catechins) showed a downward trend during the withering process.The contents of 18 proanthocyanidins (PAs) and 5 Theasinensins (TSs) showed different trends.The galloyl containing PAs and TSs showed an upward trend, while non- galloyl containing PAs and TSs showed an opposite trend.For glycoside derivatives, 6 kaempferol glycosides, 4 Quercetin (quercetin) glycoside and 1 apigenin glycoside showed an upward trend.Their contents increased significantly after 48?h withering.In the process of withering, 5 of the 12 phenolic acids showed an upward trend.While the rest 7 showed a downward trend.All of them reached their peaks or bottom at 57-60?h.In addition, 22 different metabolites including alkaloids, amino acids, peptides, coumarins, sugars, etc.were also identified.Caffeine showed an upward trend.Their contents reached the peaks at 60?h.Theobromine decreased significantly in the mid-withering period, and slightly recovered in the latter period.The contents of 2 theanine isomer and 4 coumarins rose to the peak at 12?h.After that, there was an overall downward trend during the withering process.These data offered important insights for understanding the biosynthesis and regulation mechanism of white tea during indoor natural withering process.

white tea,natural withering, non-targeted metabolomics, metabolites

S571.1；TS272.5+9

A

1000-369X(2021)03-379-14

2020-08-17

2020-11-11

國家自然科學基金（31270735）、福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT170885）、福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金（CXZX2016117）、福建農(nóng)林大學金山學院青年教師科研基金立項項目（z170701）

岳文杰，男，講師，主要從事茶葉加工與茶葉資源利用方面研究。*通信作者：jxy427@fafu.edu.cn；mjchen@xynu.edu.cn

（責任編輯：趙鋒）