趙逸清，劉政均，張?zhí)秭?，趙彥婷，肖斌，高岳芳*

茶樹(shù)基因的克隆及其在不同葉色白化茶樹(shù)中的表達(dá)分析

趙逸清1，劉政均1，張?zhí)秭?，趙彥婷1，肖斌1，高岳芳1*

1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

鎂離子螯合酶是葉綠素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，與植物葉色的白化現(xiàn)象密切相關(guān)。以陜茶1號(hào)、白葉1號(hào)、極白1號(hào)、黃金芽和黃金葉等5個(gè)茶樹(shù)品種葉片為試驗(yàn)材料，分別克隆其鎂離子螯合酶I亞基（Mg-chelatase I subunit，CHLI）編碼基因全長(zhǎng)CDS序列。多序列比對(duì)顯示，白葉1號(hào)中兩個(gè)堿基差異位點(diǎn)（G502C，C1169T）導(dǎo)致在AAA+和AAA lid結(jié)構(gòu)域中有2個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變（G168R，A390V），黃金葉中1個(gè)堿基差異位點(diǎn)（G1202A）導(dǎo)致在AAA lid結(jié)構(gòu)域中有1個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變（R401H）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，CsCHLI定位于葉綠體中，堿基或氨基酸殘基的差異并不影響其亞細(xì)胞定位。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，堿基位點(diǎn)突變會(huì)影響的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與陜茶1號(hào)相比，不同葉色白化茶樹(shù)品種中總?cè)~綠素含量分別為陜茶1號(hào)的25%～77%，基因表達(dá)量分別為陜茶1號(hào)的24%～46%。結(jié)果表明，茶樹(shù)中的基因表達(dá)與葉綠素含量呈正相關(guān)。這些結(jié)果將為深入研究在茶樹(shù)葉綠素代謝中的功能以及茶樹(shù)葉色突變的作用機(jī)理提供試驗(yàn)證據(jù)。

茶樹(shù)；；亞細(xì)胞定位；RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；葉綠素含量

葉綠素（Chlorophylls）是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，葉綠素生物合成代謝中任何一個(gè)基因的突變或缺失都會(huì)使植株呈現(xiàn)不同程度的葉色變異。近年來(lái)，在擬南芥[1]、水稻[2]、玉米[3]、黃瓜[4]、大豆[5]等多種植物中均有葉色突變體的研究報(bào)道。通常情況下，葉色突變會(huì)使植株發(fā)育遲緩、生長(zhǎng)勢(shì)減弱、生物量和產(chǎn)量降低，甚至導(dǎo)致植株死亡。但在茶樹(shù)中，不同白化程度的特異葉色突變體均具有高含量的茶氨酸和特異的外形，經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高[6-8]。因此，研究茶樹(shù)葉色特異突變體，在茶樹(shù)葉色調(diào)控機(jī)理、葉片發(fā)育、茶樹(shù)光合作用和次生代謝等研究中均有重要的理論價(jià)值。

鎂離子螯合酶（Magnesium chelatase，Mg-chelatase）是葉綠素生物合成途徑分支中的關(guān)鍵酶，在依賴ATP的條件下，催化原卟啉IX與Mg2+螯合形成鎂原卟啉IX[9]。Mg-chelatase至少由3個(gè)亞基組成，分別為I亞基（ChlI）、D亞基（ChlD）和H亞基（ChlH）。I亞基定位于葉綠體中，屬于AAA+（ATPases associated with various cellular activities）超家族，能夠結(jié)合和水解ATP為鎂離子螯合反應(yīng)提供能量[10]。在擬南芥、小麥、大豆、黃瓜、水稻、銀杏等物種中均有關(guān)于基因的突變導(dǎo)致其葉綠素合成受阻，從而呈現(xiàn)出白化的表型[4,11-15]。擬南芥中存在2個(gè)同源基因，任何基因的缺失均能使植株表現(xiàn)出黃色白化表型，而純和的雙突變體則是白化致死表型[11]。Wang等[12]研究表明，小麥中單核苷酸突變（G664A），使其葉綠素含量及其前體物質(zhì)原卟啉IX和鎂原卟啉IX的積累顯著減少，并呈現(xiàn)出明顯的淡綠色表型。Du等[13]研究表明，大豆基因中1個(gè)單堿基錯(cuò)義突變（G1709A），使Gmcd1與GmCHLI1 a/b的相互作用降低，致使葉綠素生物合成受到抑制。Gao等[4]在黃瓜EMS誘變中發(fā)現(xiàn)1個(gè)穩(wěn)定遺傳的黃葉突變體，圖位克隆結(jié)果表明，是由于黃瓜基因中單核苷酸突變（G1757A）造成的。Zhang等[14]在水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，由于單堿基突變（G529C）造成AAA+結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基改變（G177R），致使OsCHLI不能與OsCHLD互作，從而引發(fā)表型白化。上述研究結(jié)果均表明，在不同物種中，鎂離子螯合酶I亞基在葉綠素生物合成中均是必不可少的，但目前茶樹(shù)中尚未見(jiàn)基因的研究和報(bào)道。

本研究以綠色茶樹(shù)品種陜茶1號(hào)，白化白色系茶樹(shù)品種白葉1號(hào)和極白1號(hào)，白化黃色系茶樹(shù)品種黃金芽和黃金葉為材料，分別克隆了這5個(gè)品種中的全長(zhǎng)編碼序列（Coding sequence，CDS），對(duì)它們的堿基序列差異、編碼氨基酸的理化性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，構(gòu)建不同物種中CHLI的進(jìn)化樹(shù)，分析其親緣和進(jìn)化關(guān)系；同時(shí)，研究了它們的亞細(xì)胞定位、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，并分析了葉綠素含量與基因表達(dá)量的關(guān)系，以期為深入研究在茶樹(shù)葉色突變中的功能和作用機(jī)制提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為綠色茶樹(shù)品種陜茶1號(hào)，白化白色系茶樹(shù)品種白葉1號(hào)和極白1號(hào)，白化黃色系茶樹(shù)品種黃金芽和黃金葉的兩年生扦插盆栽茶苗，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室，培養(yǎng)條件為白天25℃，晚上22℃，自然光照。于2019年9月15日，分別取芽下第一葉，液氮冷凍，置于–80℃冰箱保存，用于RNA提取和葉綠素含量測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

采用CTAB法提取茶樹(shù)葉片的總RNA[16]，使用Nanodrop ND 2000（Thermo Scientific，美國(guó)）微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，利用1.2%凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按照5×All-In-One RT Master Mix（ABM生物科技有限公司，加拿大）試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因克隆

依據(jù)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)（http://tpia.teaplant.org）[17]中CsCHLI的編碼序列TEA018733.1，根據(jù)序列特征在開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)特異引物（5'-CCAACTAGTGGTAAATACCTCGTAAAATTTCTCA-3'）和（5'-CGTCCATGGCCAGTGTTCTCGGAA-3'）。PCR擴(kuò)增體系為40?μL，包括2×Phanta Max Master Mix酶20?μL，ddH2O 15?μL，模板cDNA 1?μL以及引物與各2?μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃3?min；循環(huán)反應(yīng)95℃ 30?s，56℃ 30?s，72℃ 1?min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用PCR純化試劑盒（OMEGA，美國(guó)）回收目的片段。目的片段和植物表達(dá)載體3302Y（實(shí)驗(yàn)室自備）分別經(jīng)NcoI和SpeI限制性內(nèi)切酶（TAKARA，大連）雙酶切，用T4連接酶（TAKARA，大連）連接至3302Y載體上，后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，挑取陽(yáng)性單克隆送生工生物工程股份有限公司（上海）測(cè)序。

1.2.3 CsCHLI生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)CsCHLI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。在NCBI網(wǎng)站下載24個(gè)物種的CHLI全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列，采用Geneious 9.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。采用在線工具ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）進(jìn)行氨基酸組成及理化性質(zhì)分析。采用在線工具TargetP-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）進(jìn)行信號(hào)肽分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。采用在線工具The mfold Web Server （http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）進(jìn)行5個(gè)茶樹(shù)品種的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4 CsCHLI亞細(xì)胞定位

將去除終止密碼子的連接到帶有EYFP的3302Y植物表達(dá)載體上，構(gòu)建融合表達(dá)載體35?S::CsCHLI::EYFP。以空白載體35S::EYFP為陰性對(duì)照，采用熱激法將空白載體與融合表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中。將轉(zhuǎn)化后GV3101菌液培養(yǎng)至適宜濃度（OD值1.0），3?500?r·min-1離心5?min，收集菌體，用重懸液（0.5?mol·L-1MES 200?μL，1?mol·L-1MgCl2100?μL，100?mmol·L-1乙酰丁香酮10?μL，ddH2O定容至10?mL）重懸菌體至OD值0.6～0.8，重懸菌液避光3?h后，采用無(wú)針頭的一次性無(wú)菌注射器將菌液從下表皮緩慢注射入本氏煙草葉片中，培養(yǎng)48?h后，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）觀察、拍照，并記錄結(jié)果。

1.2.5 葉綠素含量測(cè)定

參照向芬等[18]葉綠素測(cè)定方法，用95%乙醇提取茶樹(shù)葉片葉綠素，分別測(cè)定提取液在波長(zhǎng)665?nm與649?nm下的吸光值。使用Wellburn等[19]的公式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)與方差分析，利用Prism 8繪制圖表，試驗(yàn)數(shù)值以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

1.2.6基因表達(dá)量分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉色白化茶樹(shù)CsCHLI基因克隆

為探究在不同葉色白化茶樹(shù)品種中其堿基序列是否存在差異，分別以陜茶1號(hào)、白葉1號(hào)、極白1號(hào)、黃金芽和黃金葉cDNA為模板，使用特異引物和進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1-A所示。將目的片段純化、酶切并連接至3302Y載體中，選取陽(yáng)性單克隆測(cè)序，獲得各茶樹(shù)品種的CDS序列。測(cè)序結(jié)果表明，陜茶1號(hào)、白葉1號(hào)和極白1號(hào)的的CDS序列長(zhǎng)度均為1?275?bp，編碼424個(gè)氨基酸；與陜茶1號(hào)的CDS序列相比，黃金芽的堿基序列發(fā)生6個(gè)堿基的缺失，CDS長(zhǎng)度為1?269?bp，編碼422個(gè)氨基酸；黃金葉的全長(zhǎng)CDS序列發(fā)生3個(gè)堿基的插入，長(zhǎng)度1?278?bp，編碼425個(gè)氨基酸。此外，5個(gè)不同葉色茶樹(shù)品種的全長(zhǎng)CDS序列存在多處堿基差異（圖1-B）。

2.2 茶樹(shù)CsCHLI氨基酸序列比對(duì)

大多數(shù)基因最終是以蛋白質(zhì)的形式行使功能，為探究不同葉色茶樹(shù)品種基因中其堿基序列的差異是否會(huì)對(duì)其蛋白質(zhì)序列造成影響。采用ExPASy對(duì)不同葉色茶樹(shù)CsCHLI的CDS序列進(jìn)行翻譯，并利用Geneious 9.0軟件對(duì)各CsCHLI氨基酸序列和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)舒茶早CsCHLI（TEA018733.1）編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果如圖2所示，氨基酸序列分析顯示1—64為葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，95—291屬于AAA+結(jié)構(gòu)域（Pssm-ID 99707）和351—419屬于AAA lid結(jié)構(gòu)域（Pssm-ID 380038）。P18S與Q28H兩個(gè)殘基差異位點(diǎn)只在陜茶1號(hào)中存在，屬于陜茶1號(hào)與其他品種的差異。除此之外，與陜茶1號(hào)相比，在功能結(jié)構(gòu)域中，不同葉色白化茶樹(shù)品種中CsCHLI氨基酸殘基差異分別為白葉1號(hào)2個(gè)位點(diǎn)（G168R和A390V），分別屬于AAA+結(jié)構(gòu)域和AAA lid結(jié)構(gòu)域、黃金芽2個(gè)氨基酸殘基缺失（YG43-44）、黃金葉1個(gè)位點(diǎn)（R401H）屬于AAA lid結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)氨基酸殘基插入（17?S）。

2.3 CHLI蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

為進(jìn)一步分析CHLI蛋白質(zhì)的功能，利用ExPASy-ProtParam在線工具分析對(duì)茶樹(shù)、獼猴桃、咖啡、煙草、馬鈴薯和番茄等物種的CHLI蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)、相對(duì)分子量、組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示，在該6個(gè)物種中CHLI氨基酸個(gè)數(shù)為422～429，相對(duì)分子量為46.25～46.81?kDa。理論等電點(diǎn)為5.55～6.10，堿性氨基酸占比12.47%～12.97%，酸性氨基酸占比13.55%～14.45%，脂肪族氨基酸占比22.28%～23.00%，芳香族氨基酸占比4.26%～4.67%，總平均疏水性–0.258～–0.197。由表1可知，不同物種中CHLI蛋白質(zhì)的個(gè)數(shù)和理化性質(zhì)相似度很高，表明CHLI的功能在不同物種中高度保守。

注：M：DNA marker，1：陜茶1號(hào)，2：白葉1號(hào)，3：極白1號(hào)，4：黃金芽，5：黃金葉。...：相同堿基，---：缺失堿基，不同色塊表明堿基差異

Note: M: DNA Marker, 1: Shaancha 1, 2: Baiye 1, 3: Jibai 1, 4: Huangjinya, 5: Huangjinye....: same bases.---: missing bases.Different color blocks indicate base difference

圖1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（A）和序列差異位點(diǎn)（B）

Fig.1 PCR amplifications (A) and differenct gene sequences (B) of

2.4 CHLI的進(jìn)化分析

為探究茶樹(shù)CsCHLI與其他物種的親緣及進(jìn)化關(guān)系，在NCBI網(wǎng)站中，分別從藻類、苔蘚、蕨類、單子葉植物和雙子葉植物中共選取24個(gè)物種的CHLI氨基酸序列與5個(gè)不同葉色的茶樹(shù)CsCHLI氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖3-A）。結(jié)果表明，藻類、苔蘚和蕨類植物中CHLI的親緣關(guān)系較近，分布在同一個(gè)分支中；單子葉植物水稻、高粱、小米中CHLI的親緣關(guān)系較近；茶樹(shù)CsCHLI與獼猴桃親緣關(guān)系最近，與咖啡、煙草、馬鈴薯、番茄等次之。圖3-B為不同物種CHLI對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，其中黑色表示該區(qū)域在不同物種中相同的氨基酸殘基，灰白色則指示該區(qū)域存在氨基酸殘基差異。藍(lán)色與橙色方框分別為NCBI中顯示的AAA+結(jié)構(gòu)域和AAA lid結(jié)構(gòu)域。從圖3-B可以看出，不同物種中AAA+和AAA lid兩個(gè)結(jié)構(gòu)域保守性較強(qiáng)。

注：黑色線條指示葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。藍(lán)色方框區(qū)域指示AAA+結(jié)構(gòu)域，橙色方框區(qū)域指示AAA lid結(jié)構(gòu)域

Note: The black line indicates the chloroplast transit peptide.The blue box indicates the AAA+ domain, the orange box indicates the AAA lid domain

圖2 茶樹(shù)CsCHLI氨基酸序列比對(duì)

Fig.2 Alignment of amino acid sequences of CsCHLI in tea plants

表1 CHLI氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

注：藍(lán)色方框區(qū)域指示AAA+結(jié)構(gòu)域，橙色方框區(qū)域指示AAA lid結(jié)構(gòu)域

Note: The blue box indicates the AAA+ domain, the orange box indicates the AAA lid domain

圖3 CHLI進(jìn)化樹(shù)分析（A）和氨基酸序列比對(duì)（B）

Fig.3 Phylogenetic tree analysis (A) and alignment of amino acid sequences (B) of CHLI

2.5 CsCHLI亞細(xì)胞定位

用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位（圖4），以空載體35S::EYFP為對(duì)照的煙草葉片細(xì)胞中，YFP黃色熒光在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上均有分布；而轉(zhuǎn)化不同葉色茶樹(shù)品種構(gòu)建的35S::CsCHLI::EYFP融合表達(dá)載體的煙草葉片細(xì)胞中，YFP黃色熒光與葉綠體自發(fā)紅色熒光重合，表明茶樹(shù)CsCHLI定位在葉綠體中。此外，不同葉色茶樹(shù)品種35S::CsCHLI::EYFP融合蛋白均定位在葉綠體上，表明5個(gè)不同葉色茶樹(shù)品種中CsCHLI個(gè)別堿基或氨基酸殘基的差異并不影響其亞細(xì)胞定位。

2.6 茶樹(shù)CsCHLI RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為探究不同葉色白化茶樹(shù)品種中堿基差異對(duì)RNA穩(wěn)定性的影響，利用在線工具The mfold Web Server對(duì)5個(gè)茶樹(shù)品種的序列進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。與陜茶1號(hào)相比（圖5-A），白葉1號(hào)中存在7處堿基差異，莖環(huán)結(jié)構(gòu)較多，ΔG=–340.65?kkal·mol-1高于陜茶1號(hào)ΔG=–346.93?kkal·mol-1（圖5-B）；極白1號(hào)中存在4處堿基差異，莖環(huán)結(jié)構(gòu)較少，ΔG=–349.78?kkal·mol-1低于陜茶1號(hào)（圖5-C）；黃金芽中存在4處堿基差異和1處6個(gè)堿基缺失，其堿基缺失造成莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變，ΔG=–346.13?kkal·mol-1略高于陜茶1號(hào)（圖5-D）；黃金葉中存在有5處堿基差異和1處3個(gè)堿基的插入，莖環(huán)結(jié)構(gòu)減少，ΔG=–353.64?kkal·mol-1低于陜茶1號(hào)（圖5-E）。

2.7 不同葉色白化茶樹(shù)中葉綠素含量和CsCHLI基因表達(dá)量分析

為探究不同葉色白化茶樹(shù)品種中葉綠素含量和基因表達(dá)量之間的關(guān)系，分別測(cè)定其葉綠素含量并通過(guò)qRT-PCR對(duì)的基因表達(dá)量進(jìn)行分析。如圖6-A所示，與陜茶1號(hào)相比，不同葉色白化茶樹(shù)葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量均有不同程度的降低，且存在顯著性差異。其中，白葉1號(hào)葉片中葉綠素a和葉綠素b分別為陜茶1號(hào)的76%和80%；極白1號(hào)葉片中葉綠素a和葉綠素b分別為陜茶1號(hào)的44%和55%；黃金芽葉片中葉綠素a和葉綠素b分別為陜茶1號(hào)的25%和25%；黃金葉葉片中葉綠素a和葉綠素b分別為陜茶1號(hào)的31%和16%。不同葉色白化茶樹(shù)中基因表達(dá)量如圖6-B所示，與陜茶1號(hào)相比，白葉1號(hào)基因表達(dá)量降低了54%；極白1號(hào)基因表達(dá)量降低了76%；黃金芽基因表達(dá)量降低了67%；黃金葉基因表達(dá)量降低了57%。上述結(jié)果表明，與綠色茶樹(shù)相比白化茶樹(shù)中葉綠素含量和基因表達(dá)量呈正相關(guān)。

3 討論

植物白化現(xiàn)象非常普遍，但是造成白化表型的分子機(jī)制十分復(fù)雜。本研究從5個(gè)茶樹(shù)品種中克隆并分別獲得基因的堿基序列。對(duì)它們的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析可知，CsCHLI為疏水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位顯示茶樹(shù)CsCHLI定位于葉綠體中，與水稻和大豆等物種CHLI定位相吻合[14,22]。通過(guò)NCBI-CDD保守結(jié)構(gòu)域分析可知，CsCHLI分別包含AAA+結(jié)構(gòu)域和AAA lid結(jié)構(gòu)域，這與I亞基屬于AAA+超家族，并調(diào)節(jié)ATP的水解功能的作用相符[10]。

通過(guò)對(duì)5個(gè)茶樹(shù)品種基因的克隆和蛋白質(zhì)序列分析表明，不同葉色白化茶樹(shù)品種中基因的堿基序列和蛋白質(zhì)序列存在多個(gè)位點(diǎn)的差異。特別是與陜茶1號(hào)相比，黃金芽中的堿基序列發(fā)生6個(gè)堿基的缺失，黃金葉中的全長(zhǎng)CDS序列發(fā)生3個(gè)堿基的插入，但是在黃金芽和黃金葉中發(fā)生的缺失和插入的堿基數(shù)均為3的倍數(shù)，并未對(duì)閱讀框造成影響，其蛋白質(zhì)序列差異不大。Zhang等[14]報(bào)道了一個(gè)水稻黃化突變體和()，該突變體是由單堿基突變（G529C）造成AAA+結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基發(fā)生錯(cuò)義突變（G177R）。水稻中該位點(diǎn)突變并不影響亞細(xì)胞定位結(jié)果，與本研究結(jié)果一致。水稻突變體中質(zhì)體轉(zhuǎn)錄基因（，和）和光合作用相關(guān)基因（和）顯著降低，酵母雙雜交表明的錯(cuò)義突變致使OsCHLI與OsCHLD不能互作。擬南芥中研究也表明，AtCHLD的穩(wěn)定性與AtCHLI有關(guān)[11]。同時(shí)，Du等[13]報(bào)道大豆黃化突變體是由于的一個(gè)堿基發(fā)生變化（G1709A），導(dǎo)致AAA+結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基發(fā)生錯(cuò)義突變（D278N），且該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜段結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而影響Gmcd1與GmCHLI1a/b的相互作用。本研究中，白葉1號(hào)，其氨基酸序列在168和390兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸殘基的改變（G168R，A390V），分別屬于AAA+結(jié)構(gòu)域和AAA lid結(jié)構(gòu)域；黃金葉中在401位點(diǎn)發(fā)生氨基酸殘基的改變（R401H），屬于AAA lid結(jié)構(gòu)域。因此白葉1號(hào)和黃金葉中保守結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的變異是否會(huì)影響茶樹(shù)中CsCHLI與CsCHLD的互作，降低質(zhì)體基因以及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量，進(jìn)而導(dǎo)致茶樹(shù)葉色出現(xiàn)白化表型，還需進(jìn)一步功能驗(yàn)證。

圖4 茶樹(shù)CsCHLI的亞細(xì)胞定位

注：A：陜茶1號(hào)，B：白葉1號(hào)，C：極白1號(hào)，D：黃金芽，E：黃金葉，結(jié)構(gòu)的自由能標(biāo)注在圖下方。差異位點(diǎn)用紅色箭頭指出，插入位點(diǎn)用黑色箭頭指出，缺失位點(diǎn)用藍(lán)色箭頭指出

Note: A: Shaancha 1, B: Baiye 1, C: Jibai 1, D: Huangjinya, E: Huangjinye.The free energy of the structure was shown at the bottom of the picture.The difference sites were pointed out by the black arrows, and the insertion site was indicated by the black arrow, and the missing site was indicated by the blue arrow

圖5 茶樹(shù)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.5 RNA secondary structure ofin tea plants

注：SC1：陜茶1號(hào)，BY1：白葉1號(hào)，JB1：極白1號(hào)，HJYa：黃金芽，HJYe：黃金葉。*：＜0.05；**：＜0.01

Note: SC1: Shaancha 1, BY1: Baiye 1, JB1: Jibai 1, HJYa: Huangjinya, HJYe: Huangjinye.*:＜0.05.**:＜0.01

圖6 茶樹(shù)葉綠素的含量（A）和表達(dá)分析（B）

Fig.6 Chlorophyll content (A) and expression analysis of(B) in tea plants

由RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析得知，白葉1號(hào)的穩(wěn)定性低于陜茶1號(hào)，與其的基因表達(dá)量顯著低于陜茶1號(hào)結(jié)果相一致，即RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其不穩(wěn)定，在一定程度上降低了的表達(dá)（圖5，圖6-B）。上述結(jié)果初步表明，不同葉色中的堿基差異對(duì)其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和基因表達(dá)量存在一定影響，并最終影響葉綠素的生物合成，使葉片呈現(xiàn)不同程度的白化現(xiàn)象。在擬南芥不同等位突變?nèi)纾–584T）或T-DNA插入突變體中，基因表達(dá)量均有不同程度的下降，且葉片均呈現(xiàn)黃化或白化表型[11]。同樣，吳全金[23]對(duì)白化黃色系茶樹(shù)品種白雞冠進(jìn)行遮蔭處理表明，隨著遮蔭時(shí)間延長(zhǎng)，葉綠素含量逐漸增加，葉片由黃白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，基因表達(dá)量在1～3?d時(shí)顯著增加，6?d時(shí)有輕微的下降。與本研究相似，對(duì)茶樹(shù)葉片中葉綠素含量關(guān)聯(lián)分析表明，與正常綠色茶樹(shù)品種陜茶1號(hào)相比，其他4個(gè)葉色突變的茶樹(shù)品種中其葉綠素含量和的表達(dá)量均有不同程度的下降，并存在顯著性差異，這些結(jié)果表明，基因表達(dá)量與葉綠素含量呈正相關(guān)。

CHLI進(jìn)化及保守結(jié)構(gòu)域（圖3）分析表明，從低等植物藻類到高等植物中均存在CHLI，且保守性較強(qiáng)，表明CHLI在進(jìn)化過(guò)程中較保守，且是綠色生物葉綠素合成所必不可少的。此外，在不同物種中，CHLI還存在同源物，如大豆中存在4種同源物[22,24]，但是僅和在葉綠素合成中起作用；擬南芥中存在可相互替代的CHLI1與CHLI2以行使功能作用[11]，而萊茵衣藻中CHLI2不可替代CHLI1[25]。茶樹(shù)中目前僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因，但在眾多的白化茶樹(shù)資源中，是否存在其他的同源物，以及其在茶樹(shù)葉色變異和葉綠素生物合成中的具體分子機(jī)制如何，這些都是今后研究的重點(diǎn)。

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Cloning ofGene and Its Expression Analysis inDifferent Albino Tea Cultivars ()

ZHAO Yiqing1, LIU Zhengjun1, ZHANG Tianxin2, ZHAO Yanting1, XIAO Bin1, GAO Yuefang1*

1.College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

Magnesium chelatase is one of the key enzymes in the process of chlorophyll synthesis, which is closely related to the albino phenomenon of leaves.In this study, the leaves of tea cultivars Shaancha 1, Baiye 1, Jibai 1, Huangjinya and Haungjinye were used as materials to clone the full-length CDS sequences of(Mg-chelatase I subunit).Multi-sequence alignment shows that the two base differences (G502C, C1169T) were found in Baiye 1, which lead to the change of two amino acid residues (G168R, A390V) in the AAA+and AAA lid domain.Meanwhile, there was an amino acid residue changed (R401H) in the AAA lid domain of Huangjinye, due to the difference of G1202A.Subcellular localization analyses illustrates that CsCHLI is localized in chloroplast and the differences of the bases or amino acid residues did not affect its subcellular localization.The RNA secondary structure analysis shows that base site mutations ofwould affect its stem-loop structure and the stability.Moreover, the chlorophyll contents in albino tea plants were 25%-77% of that in Shaancha 1, and the expressions ofin albino tea plants were 24%-46% of that in Shaancha 1.The results show that theexpression was positively correlated with chlorophyll content in tea plants.Furthermore, these results provided experimental evidences for the in-depth study of the chlorophyll metabolism in albino tea plants.

,, subcellular localization, RNA secondary structure, chlorophyll content

S571.1；Q753

A

1000-369X(2021)03-327-10

2020-07-10

2020-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31700612）、陜西省自然科學(xué)基金（2019JQ-082）、咸陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019k01-52）

趙逸清，男，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)白化研究，zyq2019@nwafu.edu.cn。*通信作者：yuefanggao@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）