馮 蕾，李國(guó)棟，王中華，胡志勇

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

后備牛階段為奶牛生長(zhǎng)發(fā)育階段的總稱，是指從出生至第1 次產(chǎn)犢前的奶牛[1]?，F(xiàn)代化奶牛養(yǎng)殖中，由于后備牛在產(chǎn)犢前不能為牛場(chǎng)帶來經(jīng)濟(jì)效益，但生理成熟期與其體重相關(guān)[2-3]，生產(chǎn)中常通過飼喂高營(yíng)養(yǎng)高蛋白水平日糧，提高其日增重以期更早達(dá)到配種體重，但我國(guó)飼料資源緊缺，尤其是蛋白質(zhì)類飼料原料供不應(yīng)求[4]，導(dǎo)致蛋白飼料價(jià)格居高不下；同時(shí)由于奶牛生理消化特點(diǎn)導(dǎo)致蛋白利用率低，攝入的蛋白大量通過糞尿排出體外，日糧氮平均泌乳轉(zhuǎn)化效率僅為24.7%，降低氮攝入會(huì)降低糞尿中氮排泄量[5]，因此降低后備牛日糧蛋白水平的飼養(yǎng)模式需要深入研究。部分氨基酸參與代謝調(diào)控，在反芻動(dòng)物日糧中以過瘤胃保護(hù)形式添加此類氨基酸，可適當(dāng)降低日糧蛋白水平而不影響生產(chǎn)性能，可提高日糧氮轉(zhuǎn)化效率、減少糞尿氮排放[6]。蛋氨酸（Met）作為一種必需氨基酸，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并對(duì)免疫功能有重要作用[7]。亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）可以通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成[8]。在奶牛飼養(yǎng)中，補(bǔ)充氨基酸對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、消化代謝、激素調(diào)節(jié)具有積極效果。目前，低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸的相關(guān)研究主要集中在泌乳奶牛，在后備牛上鮮有報(bào)道。本研究在后備牛飼養(yǎng)中應(yīng)用低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸，以期飼喂更少的蛋白飼料以獲得較好的生長(zhǎng)速度，減少氮排泄，降低對(duì)環(huán)境的污染，為后備牛營(yíng)養(yǎng)研究和生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 過瘤胃蛋氨酸（RPMet）：包被率60%，過瘤胃率85%，小腸釋放率99%；過瘤胃亮氨酸（RPLeu）：包被率70.6%，過瘤胃率86.4%，小腸釋放率98.3%；過瘤胃異亮氨酸（RPIle）：包被率70.3%，過瘤胃率87.2%，小腸釋放率98.1%。過瘤胃氨基酸包被率為產(chǎn)品有效含量，所有包被氨基酸由杭州康德權(quán)飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和日糧 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，選取平均日齡為（211.5±1.5）d、初始體重為（219.6±5.8）kg的荷斯坦后備母牛40 頭，按照體重、日齡相近原則隨機(jī)分為5 組，每組8 頭。高蛋白日糧為正對(duì)照組（HP 組），日糧粗蛋白質(zhì)含量14.6%；低蛋白日糧為負(fù)對(duì)照組（LP組），日糧粗蛋白質(zhì)含量11.6%；低蛋白日糧+RPMet（LP+M）組；低蛋白日糧+RPIle 和RPLeu（LP+IL）組；低蛋白日糧+RPMet、RPIle 和RPLeu（LP+MIL）組。試驗(yàn)日糧參照美國(guó)NRC（2001）標(biāo)準(zhǔn)配制，試驗(yàn)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

根據(jù)NRC（2001）預(yù)測(cè)每種日糧小腸可消化氨基酸含量（表2）。實(shí)際過瘤胃氨基酸的添加量根據(jù)產(chǎn)品包被率、瘤胃降解率和小腸釋放率計(jì)算得到（表3），添加于全混合日糧（TMR）。

表2 根據(jù)NRC（2001）預(yù)測(cè)的小腸可消化必需氨基酸流量 g/d

表3 過瘤胃氨基酸的實(shí)際添加量（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

1.3 飼養(yǎng)管理 預(yù)試期10 d，正試期30 d。試驗(yàn)期間各組牛的日糧營(yíng)養(yǎng)水平保持不變，根據(jù)試驗(yàn)牛體重和剩料情況，每10 d 調(diào)整一次，TMR 每天飼喂2 次，保證采食后食槽中飼料略有剩余，單獨(dú)記錄每頭牛的采食量，自由飲水。

1.4 樣品采集

1.4.1 飼料樣品采集 在正試期第30 天的前3 d（試驗(yàn)?zāi)┢冢?，每天記錄每頭奶牛的飼料采食量及剩余量。每次采集的剩料樣品按剩料各成分鮮重比例混勻。所有樣品于65℃烘干測(cè)定初水分，粉碎至1 mm，密封保存于-20℃，備用。飼料及剩料樣品105℃下測(cè)定干物質(zhì)（DM）。

1.4.2 血樣采集 在正試期第30 天晨飼前采集尾根靜脈血10 mL，立即注入促凝管中，置于37℃水浴鍋中0.5 h，靜置后，3 500 r/min 離心15 min，收集上層血清分裝至1.5 mL 離心管，做好標(biāo)記，-20℃冰箱冷凍保存，待測(cè)血清激素生化指標(biāo)。

1.4.3 糞樣與尿樣采集 在正試期第30 天的前3 d 采用點(diǎn)采樣法[10]采集糞、尿。尿液采集用陰門按摩刺激法，收集中游尿液20 mL，將尿樣與0.072 N 的H2SO4按照1:4 的比例迅速混合固氮。將3 次采集樣品等量混勻，于-20℃冰箱保存，待測(cè)CP、肌酐。糞樣采用直腸取糞法，按比例混合，65℃烘至恒重并粉碎至1 mm，待測(cè)DM、CP、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、灰分（Ash）、酸不溶灰分（AIA）?？偰蛞毫?、總排糞量分別通過Cre[11]、AIA[12]作為內(nèi)源指示劑進(jìn)行計(jì)算而得。

其中，A1 為投料量（kg）；B1 為投料的AIA 比例（%）；A2 為剩料量（kg）；B2 為剩料的AIA 比例（%）；C為糞中AIA 比例（%）。

其中，CE 為理論后備牛每天Cre 排泄量（mmol）；D為尿液中Cre 濃度（mmol/L）；BW 為后備牛體重（kg）。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 過瘤胃氨基酸 過瘤胃氨基酸包被率由杭州康德權(quán)飼料有限公司提供；過瘤胃率測(cè)定選用3 頭約650 kg裝有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，根據(jù)奶牛營(yíng)養(yǎng)需要和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，參照NRC2001 標(biāo)準(zhǔn)配制常規(guī)飼料，自由飲水，試驗(yàn)方法和瘤胃降解率的計(jì)算參照Yu 等[13]方法；小腸釋放率通過收集在瘤胃中培養(yǎng)16 h 后的飼料殘?jiān)?，?yīng)用改進(jìn)三步體外法[14]測(cè)定。

1.5.2 日糧營(yíng)養(yǎng)成分 樣品中DM、CP、NDF、ADF、Ash、鈣（Ca）和磷（P）的測(cè)定均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[15-21]。

1.5.3 生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo) 在正試期第30 天晨飼前測(cè)量每頭牛的體重、體尺。測(cè)量時(shí)保持奶牛端正站立在平坦場(chǎng)地上，四肢直立，從后面看后腿掩蓋前腿，側(cè)望左腿掩蓋右腿。頭自然前伸，不左右偏，不高抬或下俯。四蹄落在地面呈兩條平行直線。體高為奶牛個(gè)體十字部最高點(diǎn)至水平地面的垂直高度。體斜長(zhǎng)為奶牛肩胛骨前緣至坐骨結(jié)節(jié)后緣的距離。胸圍為奶牛肩胛骨后角（肘突后緣）處量取的胸部周徑。

1.5.4 血清生化指標(biāo) 使用全自動(dòng)生化分析儀（日立，Type 7020）對(duì)血清生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的生化指標(biāo)及激素主要包括葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、尿素、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。

1.5.5 血清中激素 胰島素（INS）、胰高血糖素（GLN）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（IGF-I）、生長(zhǎng)激素（GH）、催乳素（PRL）、促黃體生成素（LH）、孕酮（P）、雌二醇（E2）由泰安市中心醫(yī)院進(jìn)行放射性免疫法測(cè)定。

1.5.6 尿樣中Cre 尿液中Cre 采用肌氨酸氧化酶法試劑盒（南京建成生物科技有限公司），使用CMax Plus微孔板讀板機(jī)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件中GLM 過程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，0.05 ≤P＜0.1 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。

2 結(jié)果

2.1 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛生長(zhǎng)性能的影響 由表4 可知，低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)各組間的后備牛體斜長(zhǎng)、體重、體高、胸圍無顯著差異；HP 組平均日增重（ADG）顯著高于LP 組（P＜0.05），LP+IL、LP+MIL 組的ADG 高于LP 組（0.05 ≤P＜0.1）。LP+IL、LP+MIL 組每千克增重所消耗蛋白量低于LP+M 組（0.05 ≤P＜0.1）。

表4 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛體重、體尺、ADG 的影響

2.2 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛血清生化指標(biāo)及激素含量的影響 由表5 可知，組間血清尿素含量差異極顯著，HP 組高于LP 組（P＜0.01），LP+IL 和LP+MIL 組與LP 組無顯著差異。各組的ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLU 及TG 均差異不顯著。LP+MIL組的GLN 含量低于其余組（P＜0.01）；各組血液中的PRL、GH、LH、INS、P、E2及IGF-I 含量均差異不顯著。

表5 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)血液生化指標(biāo)及激素含量的影響

2.3 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛營(yíng)養(yǎng)成分表觀消化率的影響 由表6 可知，各組間的總干物質(zhì)采食量差異不顯著，HP 組的CP 采食量高于LP 組（P＜0.01）。LP+IL 組的NDF 采食量小于LP 組（0.05 ≤P＜0.1），LP+IL 組ADF 采食量低于其余組（P＜0.01）。各組間的總干物質(zhì)、CP、ADF 和NDF，各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的糞中含量、表觀消化率差異不顯著。

表6 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率影響

2.4 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)氮平衡的影響 由表7 可知，HP 組的攝入氮高于LP 組（P＜0.05），LP+IL 組低于LP 組（P＜0.01）。組間的尿氮的排出量差異極顯著。LP 組尿氮占攝入氮的百分比低于HP、LP+M 組（0.05 ≤P＜0.1）。HP 組的消化氮高于其余組（P＜0.01）。LP 組保留氮高于HP、LP+M 組（P＜0.05），與LP+IL、LP+MIL 組無顯著差異。組間的糞氮、氮表觀消化率差異不顯著。

表7 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)氮消化代謝的影響

3 討 論

3.1 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛生長(zhǎng)性能的影響 本試驗(yàn)條件下，各組間的體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、體重?zé)o顯著差異，說明11.6%CP 日糧中添加RPMet、RPLeu 和RPIle 不會(huì)對(duì)7 月齡后備牛體尺產(chǎn)生消極影響，與孔凡林等[22]、崔秋佳等[23]研究結(jié)果一致。LP+M 組與HP 組和LP 組每千克增重所消耗蛋白量無顯著差異，而LP+IL 組和LP+MIL 組有低于LP+M 組的趨勢(shì)，在LP 組日糧基礎(chǔ)上補(bǔ)充Met 對(duì)7 月齡的后備牛每千克增重所消耗蛋白的量影響不是很大，各營(yíng)養(yǎng)成分的采食量隨犢牛生長(zhǎng)提高，Met 作為一碳單位供體的功能被膽堿[23]等部分取代，牛只對(duì)Met 敏感性逐漸降低，11.6%CP 日糧可以滿足其Met 需求。Met 被認(rèn)為是促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的氨基酸[24]。桑丹等[25]研究表明，Leu、Ile 可以通過對(duì)mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HP 組的ADG 高于LP 組，LP+MIL 組與HP 組的ADG 差異不顯著，但高于LP+M 組，說明降低蛋白水平并添加RPMet、RPLeu和RPIle 不會(huì)降低生長(zhǎng)性能，體重增長(zhǎng)差異小，且比單個(gè)添加氨基酸效果更顯著。有研究顯示，Leu 可以改善胰腺外分泌功能，可以增加反芻動(dòng)物小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化[26]。這可能解釋了LP+MIL 和LP+IL 組的ADG水平較高。

3.2 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)后備牛血清指標(biāo)的影響 血清尿素含量是反映機(jī)體蛋白質(zhì)氮代謝和日糧氨基酸平衡狀況的重要指標(biāo)，易受日糧蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成與瘤胃降解能力影響[27]。奶牛日糧蛋白質(zhì)在瘤胃轉(zhuǎn)化過程中，多余氨通過肝臟脫氫轉(zhuǎn)化為尿素排出體外，血清尿素是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝最終產(chǎn)物[23]。本試驗(yàn)中HP 組尿素濃度顯著高于LP 組，說明蛋白質(zhì)采食量多，尿素含量也會(huì)增加，尿素濃度隨日糧蛋白水平升高而升高；HP 組尿素水平顯著高于其余組，說明HP 組蛋白質(zhì)沉積率和合成效率低于其他各組，造成飼料資源浪費(fèi)。LP+M 組尿素水平顯著高于LP+IL 組，且有高于LP+MIL 組的趨勢(shì)，7 月齡后備牛飼喂低蛋白日糧基本可以滿足Met 需求，在LP 組日糧基礎(chǔ)上添加Met 被利用沉積的效果較Leu 和Ile 更差。

3.3 低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 有研究報(bào)道，蛋白質(zhì)和氨基酸缺乏導(dǎo)致干物質(zhì)采食量（DMI）降低[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白水平對(duì)總DMI 無影響，而且本試驗(yàn)LP 組保留氮顯著高于其他組，表明11.6%的低蛋白水平?jīng)]有造成蛋白缺乏，且11.6%CP 水平下氮利用更高效，減少資源浪費(fèi)。蛋白水平對(duì)CP 采食量產(chǎn)生影響，但糞中CP 含量與表觀消化率組間無顯著差異，HP 組尿氮顯著高于其余組，說明降低日糧蛋白水平可以顯著降低排氮量，HP 組攝入的蛋白質(zhì)會(huì)通過尿氮排出體外，污染環(huán)境。LP+M 組的尿氮占攝入氮的百分比顯著高于LP 組，而LP+IL、LP+MIL組與LP 組差異不顯著且低于HP 組，說明Met 可能促進(jìn)了尿氮排放，LP+IL、LP+MIL 組日糧氮的轉(zhuǎn)化效率較HP 組有一定提高，具體原因與機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。在數(shù)值上，LP 組的CP 采食量最低，添加RPMet、RPLeu 和RPIle 未對(duì)CP 采食量產(chǎn)生顯著影響。消化率是可消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)占攝入飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的百分率[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低蛋白日糧中添加3 種過瘤胃氨基酸對(duì)DM 和各種營(yíng)養(yǎng)成分的表觀消化率及糞中含量無顯著影響，并未提高后備牛飼喂效率，可見后備牛消化系統(tǒng)已發(fā)育完全，與孔凡林等[24]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，NDF、ADF 采食量組間顯著差異。Silva 等[30]報(bào)道，隨機(jī)體的發(fā)育成熟，12 月齡后備牛的挑食行為比4 月齡更顯著，表現(xiàn)為喜食精料、厭食粗料，CP 采食量增加，NDF 采食量下降。NDF 采食量低可以認(rèn)為采食更多精料，然而本試驗(yàn)條件下低蛋白日糧中苜蓿是主要的蛋白來源，挑食意味苜蓿采食量減少，CP 攝入量的減少，LP+IL 組的氮攝入量顯著低于其余各組，可能是由于該組牛挑食情況最嚴(yán)重導(dǎo)致，LP+ILM 組的NDF 采食量與HP 組無顯著差異，這提示低蛋白日糧添加RPMet、RPIle、RPLeu 的聯(lián)合作用促進(jìn)了食欲，減少了挑食行為，機(jī)制可能為下丘腦mTORC1 通路在調(diào)控食欲調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，其作為感應(yīng)器感應(yīng)日糧氨基酸的變化，影響了食欲調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)采食量[31]。同樣解釋了LP+MIL 組血清尿素水平高于LP 組。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧下，7月齡后備牛飼喂低蛋白日糧添加過瘤胃氨基酸的日糧1個(gè)月對(duì)DMI、各營(yíng)養(yǎng)成分消化率沒有影響，但一定程度上提高了日糧氮的轉(zhuǎn)化效率。對(duì)于生長(zhǎng)性能來說，日糧蛋白質(zhì)水平降低3 個(gè)百分點(diǎn)并補(bǔ)充RPMet、RPLeu、RPIle，共同添加比單個(gè)添加的效果更為明顯。