周思彤，王永勝，田衛(wèi)花，魏曼，李莎莎，竇嬌瑩

甘肅省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,甘肅蘭州730050

2020 年 1 月 12 日,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)正式將引起新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)的病原體命名為“2019 新型冠狀病毒”(2019 Novel CoronaVirus,2019-nCoV),國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)命名為重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)。2019-nCoV 傳染性強(qiáng),其核酸檢測(cè)是目前診斷2019-nCoV 引起的COVID-19 的金標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有較高的特異性和敏感性,是目前核酸定量檢測(cè)較為理想的方法之一。室內(nèi)質(zhì)量控制(indoor quality control,IQC)是確定檢測(cè)結(jié)果是否可靠、能否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)重要措施［1］。而第三方商品質(zhì)控品不易獲得、價(jià)格昂貴。根據(jù)上述情況,本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際工作,對(duì)自制2019-nCoV 核酸檢測(cè)室內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品的可行性進(jìn)行分析,并評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 陽(yáng)性對(duì)照品來自復(fù)星長(zhǎng)征2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒(含2019-nCoV RNA 的假病毒),購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；圣湘病毒RNA 提取試劑盒及圣湘2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR 法)購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司；置有正常人鼻咽試子的病毒保存液購(gòu)自西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)(ABI-stepOne 型)購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.2 質(zhì)控品的制備 將陽(yáng)性對(duì)照品于室溫放置,完全復(fù)融后,用混勻器充分混勻,置有正常人鼻咽試子的病毒保存液制成稀釋液,將陽(yáng)性對(duì)照原液倍比稀釋(1︰1 ～ 1︰64),按照病毒 RNA 提取試劑盒說明書步驟提取病毒RNA 作為模板,按照2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系并預(yù)設(shè)反應(yīng)程序,熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)ORFlab 基因的Ct值,確定大致稀釋比例。最終將陽(yáng)性對(duì)照品48 倍稀釋后作為低值質(zhì)控品(nCov-L),Ct 值約為34；6 倍稀釋后作為高值質(zhì)控品(nCov-H),Ct 值約為31。分裝入高壓滅菌后的無RNA 酶離心管中,每支0.25 mL,-80 ℃保存。

1.3 靶值確定與質(zhì)控品的應(yīng)用 每天隨機(jī)取出1 支質(zhì)控品,隨當(dāng)日常規(guī)樣本共同檢測(cè),ORFlab 基因和衣殼蛋白N 基因的檢測(cè)通道均檢測(cè)到S 型擴(kuò)增曲線,且Ct 值≤33 判為陽(yáng)性,分析陽(yáng)性符合率。記錄室內(nèi)質(zhì)控品的Ct 值。連續(xù)檢測(cè)20 d,計(jì)算室內(nèi)質(zhì)控品Ct 值的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(SD),確定Levey-Jennings(L-J)質(zhì)控圖的控制限。將第21 天及之后的結(jié)果繪制在L-J 質(zhì)控圖中,依照12s、13s 質(zhì)控規(guī)則,對(duì)每次試驗(yàn)進(jìn)行分析。1 個(gè)月后,將該月的在控結(jié)果與前20個(gè)質(zhì)控測(cè)定結(jié)果匯總,計(jì)算累積靶值；再以此累積靶值作為下個(gè)月的質(zhì)控靶值；重復(fù)上述過程,連續(xù)檢測(cè)3 個(gè)月,將最初20 個(gè)質(zhì)控測(cè)定結(jié)果與前3 個(gè)月的在控結(jié)果匯總,計(jì)算累積靶值,作為最終靶值［2-3］。

1.4 質(zhì)控品的效果評(píng)價(jià)

1.4.1 均一性評(píng)價(jià) 在凍存的高低值質(zhì)控品中各隨機(jī)抽取30 支,檢測(cè) ORFlab 和N 基因,記錄Ct 值,并計(jì)算及變異系數(shù)(CV),判斷各管間差異。

1.4.2 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.4.2.1 不同溫度下的穩(wěn)定性 隨機(jī)抽取高低值質(zhì)控品各16 支,各分成4 組,每組4 支,分別于37℃、室溫(22 ～ 25 ℃)、2 ～ 8 ℃、-20 ℃條件下放置。每天在4 組中分別取1 支檢測(cè)ORFlab 和N 基因,連續(xù)檢測(cè) 4 d,記錄 Ct 值,并計(jì)算± s 和 CV。

1.4.2.2 長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 每日各取1 支高低值質(zhì)控品,隨當(dāng)日新冠病毒核酸樣本一起檢測(cè),連續(xù)6個(gè)月,分析每天的結(jié)果是否在控,并比較各月均值是否有差異。

1.4.2.3 反復(fù)凍融穩(wěn)定性 隨機(jī)抽取高低值質(zhì)控品各 12 支,各分成 4 組,每組 3 支,置于-20 ℃,待樣本完全冷凍,全部取出融化,1 組保存于2 ～8 ℃,進(jìn)行檢測(cè),剩余3 組再次冷凍；依照上述過程重復(fù),直至4 組全部檢測(cè)完畢［4］。分析結(jié)果是否在控。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 靶值的確定與質(zhì)控品的應(yīng)用 對(duì)質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)20 d,高低值質(zhì)控品陽(yáng)性符合率均為100%。暫定靶值和最終靶值見表1。

2.2 質(zhì)控品的效果評(píng)價(jià)

2.2.1 均一性 高低值各30 支室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果的CV 均＜5%,表明批內(nèi)無顯著性差異,均一性良好。見表2。

表1 自制質(zhì)控品的靶值Tab.1 Target values of self-made quality control references

表2 自制質(zhì)控品的均一性Tab.2 Uniformity of self-made quality control references

2.2.2 穩(wěn)定性

2.2.2.1 不同溫度下的穩(wěn)定性 隨著放置溫度的升高,室內(nèi)質(zhì)控品的CV 有所增加,直至37 ℃放置3 d后,各值出現(xiàn)失控結(jié)果,CV 明顯升高,低值質(zhì)控品N基因無擴(kuò)增曲線,見表3。

2.2.2.2 長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性 6 個(gè)月內(nèi),高低值質(zhì)控品測(cè)定值均在控,測(cè)定結(jié)果基本均勻分布在靶值兩側(cè),并在± 2 SD 范圍內(nèi)。各月均值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 分別為 0.852 和 0.884,P 分別為 0.128 和0.131),見表 4。

2.2.2.3 反復(fù)凍融穩(wěn)定性 每組質(zhì)控品反復(fù)凍融3次后,高低值結(jié)果仍在控,凍融第4 次后,結(jié)果失控。

表3 不同溫度下自制質(zhì)控品的穩(wěn)定性Tab.3 Stability of self-made quality control references at various temperatures

表4 自制質(zhì)控品的長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性(Ct,± s,n = 5)Tab.4 Stability of quality control references after long-term storage in forzen(Ct,± s,n = 5)

表4 自制質(zhì)控品的長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性(Ct,± s,n = 5)Tab.4 Stability of quality control references after long-term storage in forzen(Ct,± s,n = 5)

nCov-H 時(shí)間(月)nCov-L ORFlab N ORFlab N 1 30.52 ± 0.53 32.10 ± 0.39 33.82 ± 0.65 34.81 ± 0.46 2 30.54 ± 0.49 32.23 ± 0.51 34.01 ± 0.50 34.90 ± 0.48 3 31.19 ± 0.46 32.15 ± 0.43 33.72 ± 0.69 34.88 ± 0.54 4 31.38 ± 0.45 32.82 ± 0.41 34.27 ± 0.76 35.04 ± 0.44 5 31.43 ± 0.61 32.07 ± 0.54 34.21 ± 0.63 34.76 ± 0.67 6 31.20 ± 0.63 32.22 ± 0.48 34.03 ± 0.72 35.07 ± 0.63

3 討 論

2019-nCoV 后疫情時(shí)期,核酸檢測(cè)是最重要的防疫手段,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第7 版)》中將核酸檢測(cè)列為確診指標(biāo)之一［5］,目前多地區(qū)已進(jìn)行全民篩查,對(duì)無癥狀感染者進(jìn)行全面排查,可盡早發(fā)現(xiàn)潛在的傳染源。而室內(nèi)質(zhì)控是開展實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。對(duì)于感染性疾病病原體核酸的PCR 檢測(cè),理想的室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)具備以下條件［6-7］:基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本一致；所含待測(cè)物濃度應(yīng)接近試驗(yàn)的決定水平；有很好的穩(wěn)定性；靶值或預(yù)期結(jié)果已定；無已知的生物傳染危險(xiǎn)性；單批可大量獲?。粌r(jià)廉。

本研究采用了稀釋第三方試劑盒陽(yáng)性對(duì)照的方法自制質(zhì)控品,該陽(yáng)性樣本為2019-nCoV 假病毒培養(yǎng)液,含ORFlab 和N 基因,參與病毒RNA 提取過程,樣本來源無已知生物危險(xiǎn)傳染性、無明顯PCR抑制物,具有相對(duì)安全、來源容易、成本低廉、易大量獲取等特點(diǎn)。用置有正常人鼻咽試子的病毒保存液制成稀釋液,所含待測(cè)物濃度應(yīng)接近試驗(yàn)的決定水平。同時(shí)制備了弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性2 個(gè)濃度的質(zhì)控品,從不同濃度水平判斷檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,對(duì)決定能否發(fā)出臨床報(bào)告具有一定的指導(dǎo)意義。對(duì)于定性實(shí)驗(yàn)的非定值質(zhì)控品,本研究將Ct 值作為靶值,分別通過前20 次、3 個(gè)月的測(cè)定結(jié)果確定暫定靶值和最終靶值,陽(yáng)性符合率為100%。均一性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,隨機(jī)抽取的各濃度質(zhì)控品批內(nèi)均一性良好,CV 均小于5%。自制質(zhì)控品在不同溫度下(-20 ～22 ℃)均能短期保存,37 ℃放置超過2 d 后,核酸降解。反復(fù)凍融3 次后,檢測(cè)結(jié)果仍在控,凍融4 次,核酸降解,與血清作為介質(zhì)的HIV 自制質(zhì)控品相比,反復(fù)凍融的穩(wěn)定性一致［8-10］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,用于核酸檢測(cè)的樣本一般于-80 ℃可穩(wěn)定保存多年［11-12］,由于2019-nCoV 疫情突發(fā)至今仍不足1 年,含病毒RNA 的鼻咽拭子樣本是否同樣穩(wěn)定尚未見報(bào)道,但同樣作為RNA 病毒,HCV-RNA 臨床樣本在-20 ℃保存1.2 年和-70 ℃保存9 年才會(huì)出現(xiàn)明顯降解［10］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,HCV-RNA 自制質(zhì)控品可在-70 ℃穩(wěn)定至少1 年［10-13］,不同研究報(bào)道的RNA 檢測(cè)質(zhì)控品穩(wěn)定性差異較大,可能與操作人員、檢測(cè)儀器、檢驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有關(guān)［6,14］,本研究暫時(shí)分析了自制質(zhì)控品-80 ℃保存6 個(gè)月的穩(wěn)定性,后續(xù)將分析更長(zhǎng)保存時(shí)間的穩(wěn)定性。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)室自制2019-nCoV 室內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品樣本來源容易,制備過程簡(jiǎn)單,成本低廉,樣品均一行、穩(wěn)定性良好,低、高兩種濃度均可初步在本實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制工作中使用。