盧錦標(biāo)，都偉欣，蘇城，沈小兵，陳保文，蒲江，趙愛(ài)華

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京102629；2.安徽智飛龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司,安徽合肥230039

純蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)皮膚試驗(yàn)自問(wèn)世以來(lái),一直是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染篩查的主要手段,由于其操作簡(jiǎn)單,成本低廉,可實(shí)現(xiàn)基層大規(guī)模人群檢測(cè),因此被廣泛用于結(jié)核病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查［1］。但隨著卡介苗(BCG)的大規(guī)模應(yīng)用,PPD 的缺陷開(kāi)始顯現(xiàn)。由于共享抗原譜,PPD 不能區(qū)分Mtb感染和BCG 接種,因此特異性較差。近年發(fā)展起來(lái)的新型體外診斷方法——γ 干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay,IGRA),采用Mtb 特異性抗原,解決了PPD 特異性低的問(wèn)題。早期PPD 皮膚試驗(yàn)用于Mtb 潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)調(diào)查,并據(jù)此估計(jì)世界約 1 ／ 3 人口為 LTBI［2］；而目前采用IGRA 篩查的LTBI 數(shù)據(jù)估計(jì)明顯低于此比例［3］。但I(xiàn)GRA 對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件要求較高,且價(jià)格較貴,世界衛(wèi)生組織并不推薦將IGRA 作為低收入國(guó)家和一些中收入國(guó)家的Mtb 感染者的篩查手段［4］。我國(guó)作為BCG 普遍接種國(guó)家,也是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家,LTBI 人數(shù)巨大,需要簡(jiǎn)便、特異和高通量的新型診斷方法［5］。

借鑒傳統(tǒng)PPD 的皮試方法,本實(shí)驗(yàn)室早期選擇Mtb 中存在而BCG 中丟失的east6 基因,研發(fā)了第一代Mtb 感染鑒別抗原11kDa［6］；之后通過(guò)增加新抗原CFP10,以提高制劑的靈敏度,構(gòu)建了第二代Mtb感染鑒別抗原重組ESAT6-CFP10 融合蛋白(簡(jiǎn)稱EC)［7-9］。在臨床前研究中,本文以BCG 致敏豚鼠和PPD 試劑為對(duì)照,平行比較了11kDa 和EC 對(duì)Mtb 感染豚鼠的檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) Hartley 豚鼠,雌性,18 只,300 ～400 g ／ 只,由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(京)2014-0013,在該院分枝桿菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 菌株及疫苗 Mtb H37Ra(CMCC93020)由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供,培養(yǎng)后用比濁管比濁濃度,用生理鹽水稀釋至 2 mg ／ mL；BCG 由中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室制備,濃度為 2 mg ／ mL。

1.3 主要試劑 EC 由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供；11kDa 由北京祥瑞生物制品有限公司提供；TB-PPD 標(biāo)準(zhǔn)品(50 IU ／ mL)由中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室制備。

1.4 動(dòng)物分組及致敏 將豚鼠隨機(jī)分為Mtb 致敏組(12 只)和 BCG 致敏組(6 只)。Mtb 致敏組每只豚鼠經(jīng)大腿腹股溝皮下注射2 mg ／ mL H37Ra 活菌菌液0.5 mL。BCG 致敏組每只豚鼠經(jīng)大腿腹股溝皮下注射 2 mg ／ mL BCG 菌液 0.5 mL。

1.5 皮試試驗(yàn) 所有豚鼠致敏5 周后進(jìn)行皮試試驗(yàn)。Mtb 致敏組分為 2 個(gè)亞組(6 只 ／ 亞組),由 2 人分別獨(dú)立完成皮試,BCG 致敏組由1 人完成皮試。皮試時(shí),取重組EC 和11kDa 蛋白,分別稀釋至10、5、2.5 μg ／ mL,以輪圈法在豚鼠背部?jī)蓚?cè)拔毛后,皮內(nèi)注射,0.1 mL ／ 只；同時(shí)注射 TB-PPD 標(biāo)準(zhǔn)品,0.1 mL ／ 只,作為陽(yáng)性對(duì)照。皮試 24 和 48 h 后,盲法觀察和記錄局部硬結(jié)的縱徑及橫徑,并求其平均值(縱徑和橫徑相加除以2),判定標(biāo)準(zhǔn)為平均紅暈或硬結(jié)反應(yīng)直徑 ＜5 mm 為陰性,≥ 5 mm 為陽(yáng)性,≥ 10 mm 為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,相同濃度的EC 和11kDa 的皮試反應(yīng)大小比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn),24 和48 h 皮試反應(yīng)大小比較采用二元方差分析后的Sidak′s 多重比較檢驗(yàn),以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EC 和11kDa 對(duì)Mtb 致敏豚鼠的皮試反應(yīng) 24和48 h 的觀察結(jié)果比對(duì)顯示,PPD 對(duì)所有豚鼠的皮試試驗(yàn)均為強(qiáng)陽(yáng)性,表明豚鼠致敏成功。

24 h 皮試反應(yīng)結(jié)果顯示,0.25、0.5 和 1 μg 劑量下的EC 和11kDa 的皮試反應(yīng)均為強(qiáng)陽(yáng)性,且同劑量下兩者的反應(yīng)大小均接近,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第 1 次試驗(yàn):t 分別為 1.305、0.790 6 和 0.291 1,P 均 ＞ 0.05；第 2 次試驗(yàn):t 分別為 0.307 1、0.176 2和1.168,P 均 ＞0.05)。表明2 種制劑對(duì)Mtb 致敏豚鼠的檢測(cè)效果相當(dāng)；同時(shí),以EC 和11kDa 劑量的自然對(duì)數(shù)值(ln 值)對(duì)反應(yīng)大小累計(jì)值建立線性回歸,在 0.25 ～ 1 μg 劑量范圍內(nèi),EC 和 11kDa 的皮膚反應(yīng)大小均呈明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)圖1 和圖2。

48 h 皮試反應(yīng)結(jié)果顯示,0.25、0.5 和 1 μg 劑量的EC 和11kDa 的皮膚反應(yīng)均為強(qiáng)陽(yáng)性,且同劑量下兩者的反應(yīng)大小差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第1 次試驗(yàn):t 分別為 0.265 4、0.840 7 和 0.121 1,P 均 ＞0.05；第 2 次試驗(yàn):t 分別為 1.085、0.395 3 和 0.933 7,P 均 ＞ 0.05),見(jiàn)圖 3。

與24 h 比較,48 h 的皮試反應(yīng)大小略有下降,其中 0.25 μg 劑量 EC 以及 0.25、0.5 和 1 μg 劑量11kDa 的24 和48 h 皮試反應(yīng)大小差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分 t 分別為 4.457、5.526、3.565 和 2.987,P均 ＜0.05),見(jiàn)圖4。

2.2 EC 和11kDa 對(duì)BCG 致敏豚鼠的皮試反應(yīng)比較 PPD 對(duì)所有BCG 致敏豚鼠均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),24 和48 h 的平均皮試反應(yīng)大小分別為(17 ± 2)和(15 ± 2)mm,而不同劑量的 EC 和 11kDa 在 24 和48 h 的皮試反應(yīng)均為陰性。表明2 種制劑對(duì)BCG致敏豚鼠也具有相同的反應(yīng)性。

圖1 Mtb 致敏豚鼠24 h 皮試反應(yīng)大小Fig.1 Skin test reaction 24 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

圖2 線性回歸圖Fig.2 Linear regression of skin test reaction

圖3 Mtb 致敏豚鼠48 h 皮試反應(yīng)Fig.3 Skin test reaction 48 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

圖4 Mtb 致敏豚鼠48 h 與24 h 皮試反應(yīng)的比較Fig.4 Skin test reactions 48 and 24 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

3 討 論

Mtb 復(fù)合群特有的RD 區(qū)在卡介菌和大部分非結(jié)核分枝桿菌中均缺失,為結(jié)核病診斷新技術(shù)和結(jié)核新疫苗的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。目前,利用RD-1 區(qū)相關(guān)抗原,如 ESAT6、CFP10、MPT64、TB7.7 等,開(kāi)發(fā)的IGRA 技術(shù)已成功應(yīng)用于結(jié)核病診斷和潛伏感染人群篩查［10-11］。與IGRA 相比,新型皮內(nèi)診斷制劑,采用傳統(tǒng)PPD 的皮試方法,具有更高的性價(jià)比,近年發(fā)展迅速。本實(shí)驗(yàn)室先后研發(fā)了重組11kDa 和EC 2種Mtb 感染鑒別抗原,用于解決PPD 無(wú)法區(qū)分Mtb 感染和BCG 接種的問(wèn)題,在臨床前動(dòng)物模型上均獲得良好的驗(yàn)證［8,12-13］。本研究中,對(duì)不同劑量的11kDa和EC 進(jìn)行了平行比較并探討其劑量效應(yīng)關(guān)系。

11kDa 作為第一代鑒別抗原,僅以RD-1 區(qū)ESAT6抗原為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建；之后發(fā)展的第二代鑒別抗原EC,為ESAT6 和CFP10 串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白。臨床研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核病患者PBMC 對(duì)ESAT6 或者CFP10抗原的應(yīng)答程度不一,部分患者僅對(duì)其中一種抗原響應(yīng)強(qiáng)［14-15］。因此,聯(lián)合2 種抗原可提高檢測(cè)的靈敏度,同時(shí)并不降低特異度。不過(guò)在本研究中,盡管EC 較11kDa 增加了抗原CFP10,但對(duì)Mtb 感染的豚鼠,兩者皮膚反應(yīng)均呈強(qiáng)陽(yáng)性,且大小沒(méi)有顯著差異,與早期研究一致［12］。表明在動(dòng)物模型上未觀察到抗原種類多樣性帶來(lái)的實(shí)質(zhì)益處,提示動(dòng)物過(guò)高的攻毒劑量與人自然狀態(tài)下的機(jī)會(huì)感染不一樣,反映了動(dòng)物感染模型難以完全模擬人的感染狀態(tài)。

通過(guò)對(duì) 0.25、0.5、1 μg 梯度劑量的皮試結(jié)果分析,尤其是24 h 的結(jié)果,表明EC 和11kDa 的皮試反應(yīng)具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,即皮試劑量越大,皮試反應(yīng)越強(qiáng)。同時(shí),考慮低劑量(0.25 μg)的皮試反應(yīng)也呈強(qiáng)陽(yáng)性,提示需進(jìn)一步研究更寬劑量范圍內(nèi)的線性相關(guān)性,并為臨床研究安全性的劑量爬坡設(shè)定提供參考。此外,48 h 皮試反應(yīng)大小均小于24 h,部分劑量呈顯著差異。實(shí)際上,除了大小的變化,48 h 反應(yīng)的紅暈較24 h 顏色更淡,表明其反應(yīng)已處于衰退期。因此,與PPD 動(dòng)物皮試常以48 h 觀察結(jié)果為主不同,EC 和11kDa 誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)可能以24 h 結(jié)果判定為宜。此外,EC 和11kDa 誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)以紅暈為主,偶見(jiàn)硬結(jié),這與PPD 主要誘導(dǎo)產(chǎn)生硬結(jié)也不相同,提示其遲發(fā)型超敏反應(yīng)的機(jī)理可能存在差異。

除了在Mtb 感染豚鼠上EC 和11kDa 表現(xiàn)出相近的檢測(cè)效果,對(duì)BCG 致敏的豚鼠,兩者也具有相同的反應(yīng)性——不會(huì)誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。而PPD對(duì)BCG 致敏豚鼠呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。表明動(dòng)物模型上,EC 和11kDa 在對(duì)Mtb 感染和BCG 接種的鑒別診斷具有相一致的檢測(cè)效能,相比傳統(tǒng)的PPD,優(yōu)勢(shì)明顯。而EC 較11kDa 增加抗原后是否能獲得更高的靈敏度,仍需通過(guò)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。