曹蘭，沈克飛，王瑞生，張邑帆，高麗嬌，張祖蕓，曹聯(lián)飛

1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶402460；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,云南紅河 661101；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,浙江杭州310021

囊狀幼蟲病病毒(sacbrood virus,SBV)是危害蜜蜂健康的主要病毒之一,在各國普遍流行［1］。SBV感染能造成幼蟲死亡或不能成蛹,縮短成蜂壽命,影響蜂群群勢［2］。相對于西方蜜蜂(Apis mellifera),包括中華蜜蜂(Apis cerana cerana)在內(nèi)的東方蜜蜂(A.cerana)對SBV 更易感,感染產(chǎn)生典型癥狀,所造成的危害更大［3］。SBV 為單股正鏈昆蟲小RNA樣病毒(picorna-like virus),現(xiàn)被劃入傳染性軟化病病毒屬(Iflavirus)?；蚪M除去Poly A 尾后約含8 830 個堿基,G ／ C 含量低(約占 37%),僅有 1 個大的開放閱讀框架(open reading franme,ORF),約占基因組長度的97%,編碼約2 860 個氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein)。在病毒自身編碼蛋白酶的作用下,多聚蛋白氨基端剪切、加工產(chǎn)生成熟的結(jié)構(gòu)蛋白,羧基端剪切、加工產(chǎn)生為非結(jié)構(gòu)蛋白,包括RNA解旋酶、RNA 依賴的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)及蛋白酶。

SBV 主要包含2 大基因型,即亞洲及歐洲基因型(或稱東方及西方蜜蜂基因型),分別感染東方及西方蜜蜂［3-5］。分子進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn),一些在亞洲飼養(yǎng)的西方蜜蜂感染的SBV(AmSBV)屬亞洲基因型［6-8］。這些屬亞洲基因型的AmSBV 中,或是亞洲與西方基因型毒株的重組體,或是與同亞型的東方蜜蜂的SBV(AcSBV)在基因組水平上具有高度相似性［8-10］。人工感染試驗(yàn)證實(shí),AcSBV 能感染西方蜜蜂,在成蜂及幼蟲中均能檢出AcSBV［11-12］。

目前,GenBank 上公布來自自然感染的中國西方蜜蜂的SBV(AmSBV-Chn)序列僅有1 株全基因組序列(登錄號:MG733283),其與AcSBV 有高同源性,屬亞洲基因型［13］。另外,GenBank 上還公布了多株SBV 的RdRp 基因序列,建立在RdRp 基因的分子進(jìn)化分析得出AmSBV-Chn 屬亞洲基因型［14］。

本研究采用RT-PCR 方法從自然感染SBV 的云南西方蜜蜂幼蟲樣本中分段擴(kuò)增SBV 多聚蛋白基因,進(jìn)行序列測定及序列分析,在多聚蛋白基因水平上分析分子進(jìn)化關(guān)系,以更全面地展示目的基因的分子特性和SBV 遺傳多樣性,為進(jìn)一步研究SBV 與宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本、菌株及載體 3 份西方蜜蜂幼蟲樣本于2017 年3 月份采自云南省紅河,經(jīng)RT-PCR 檢測為SBV 陽性［15］；感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α 購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T 載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 主要試劑 rTap 酶、MineBEST Viral RNA ／ DNA Extraction Kit 及 PrimeScript RT-PCR Kit 試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 使用文獻(xiàn)［8］及［16］中的引物對3 份樣本進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,將得到的片段進(jìn)行序列測定及比對,經(jīng)BLAST 分析所得片段區(qū)域與GenBank 登錄號 AF469603、KP296800、KJ959613 及AF092924 的SBV 基因組序列有高同源性,根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增SBV 基因組的引物Tab.1 Primers for amplification of SBV genome

1.4 SBV 基因組的擴(kuò)增 采用RT-PCR。將3 份冷凍樣本解凍,取50 ～100 μL 樣本滲出液,按Mine BEST Viral RNA ／ DNA Extraction Kit 試劑盒說明書提取總RNA。使用PrimeScript RT-PCR Kit 試劑盒及隨機(jī)引物Random 6 mers,以提取的RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1 條鏈,以cDNA 為模板進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,退火30 s(退火溫度按引物的理論退火溫度作適當(dāng)調(diào)整),72 ℃延伸(時間按擴(kuò)增片段大小作適當(dāng)調(diào)整),共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后加入 10 μL 6 × Loading Buffer,PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳(含5% Goldview 核酸染料)分析。

1.5 序列測定 按DNA 凝膠回收試劑盒說明書回收1.4 項(xiàng)的目的片段。使用擴(kuò)增目的條帶的引物對回收的目的條帶進(jìn)行雙向測序。將不能順利測序或達(dá)不到拼接要求的目的產(chǎn)物克隆至pMD18-T 載體中,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子,用pMD18-T 載體上的通用引物M13+ ／ M13-篩選克隆有目的片段的陽性克隆,用引物M13+ ／ M13-對插入片段進(jìn)行雙向序列測定。若片段過長,則根據(jù)已測得的序列設(shè)計(jì)測序引物,對不能完全配對的部分序列重新進(jìn)行測序。

1.6 序列拼接及比對、重組、分子進(jìn)化分析 將已測定序列在NCBI 上用BLAST 搜索,進(jìn)行同源性分析,并找出序列同源部分；使用DNAMAN 8 轉(zhuǎn)換DNA 雙鏈中的反向互補(bǔ)鏈,通過序列比對查找正反雙鏈完全配對的2 條序列的首尾重疊部分,刪除1條序列3′端的重疊部分與對應(yīng)的另1 條序列的5′連接,依次將分段擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接,以得到SBV多聚蛋白基因序列。使用核苷酸序列翻譯軟件Translate(http:／ ／ web.expasy.org ／ translate ／)翻譯所得片段,用 ClustalW 2 軟件(http:／ ／ www.ebi.ac.uk ／Tools ／ msa ／ clustalo ／)對該序列及其與 GenBank 公布的SBV 基因組序列或多聚蛋白基因序列進(jìn)行多序列比對分析；用RDP 4 軟件對該序列與GenBank公布基因組序列或多聚蛋白基因序列的SBV 進(jìn)行重組分析；采用MEGA 4 軟件的鄰接法(neighborjoining method,NJ)基于多聚蛋白基因及RdRp 基因構(gòu)建SBV 的分子進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,RT-PCR 擴(kuò)增得到13 條與預(yù)期大小相同的目的基因片段(電泳圖略)。

2.2 序列拼接 序列測定及BLAST 分析顯示所有目的片段僅與SBV 有同源性,表明擴(kuò)增到可覆蓋SBV 完整多聚蛋白基因的目的片段。經(jīng)序列拼接,得到3 條長8 736 nt 的SBV 序列(標(biāo)記為AmSBVYN),占SBV 基因組長度的97%,包含整個多聚蛋白基因,編碼區(qū)為155 ～8 734 位堿基,編碼2 859個氨基酸殘基。

2.3 序列分析 經(jīng)序列比對,3 條AmSBV-YN 序列的同源性大于99%,與GenBank 公布的SBV 基因組序列的同源性為91% ～93%,與RdRp 序列的同源性大于91%,與AmSBV-Chn 的RdRp 序列同源性大于97%。與中國南方中華蜜蜂的SBV(AcSBV-S.Chn)_AF469603 比較,AmSBV-YN 在非結(jié)構(gòu)蛋白基因的6 520 與6 521 位堿基間缺失 1 個堿基,在6 571 與 6 572 位堿基間缺失 2 個堿基,見圖 1；致使6 521 ～6 571 位核苷酸發(fā)生移碼突變,在該區(qū)域缺失1 個氨基酸殘基,見圖2。多聚蛋白N-端部分為結(jié)構(gòu)蛋白,在 227 ～ 402、522 ～ 695 和 805 ～ 997位氨基酸殘基區(qū)域有3 個獨(dú)立的小RNA 病毒樣結(jié)構(gòu)蛋白的藥物結(jié)合口袋保守結(jié)構(gòu)域,C-端部分為非結(jié)構(gòu)蛋白,在1 391 ～1 500 位氨基酸殘基區(qū)域有RNA解旋酶保守結(jié)構(gòu)域,在2 517 ～2 777 位氨基酸殘基區(qū)域?yàn)镽dRp 保守結(jié)構(gòu)域。序列已提交GenBank,登錄號為 KX819276、KY774627 和 KY774628。

圖1 SBV 非結(jié)構(gòu)蛋白基因核苷酸插入／ 缺失區(qū)域Fig.1 Nucleotide insection ／ deletion region in non-structural protein gene of SBV

圖2 SBV 非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸殘基插入／ 缺失區(qū)域Fig.2 Amino acid residue insection ／deletion region in nonstructural protein of SBV

2.4 重組分析 經(jīng)RDP 4 軟件分析,AmSBV-YN 除與韓國西方蜜蜂的SBV(AmSBV-Kor)_KP296800 在5′端可能發(fā)生重組外,未發(fā)現(xiàn)與其他SBV 毒株發(fā)生重組,見圖3。

2.6 進(jìn)化樹分析 多聚蛋白基因進(jìn)化樹分析顯示,AmSBV-YN 單獨(dú)構(gòu)成云南基因型,AcSBV 及與其有高同源性的越南西方蜜蜂的SBV(AmSBV-Vie)和AmSBV-Kor 構(gòu)成亞洲基因型,其他AmSBV 構(gòu)成西方基因型,見圖4；該結(jié)果與RdRp 基因進(jìn)化樹分析類似,AmSBV-YN 與其他AmSBV-Chn 聚集一起構(gòu)成云南基因型,見圖5。

圖 3 AmSBV-YN 與 AmSBV-Kor_KP296800 的重組分析Fig.3 Analysis of recombination of AmSBV-YN and AmSBV Kor_KP296800

圖4 SBV 多聚蛋白基因的NJ 進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of SBV based on polyprotein gene by neighbor-joining method

圖5 SBV RdRp 基因的NJ 進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SBV based on RdRp gene by neighbor-joining method

3 討 論

盡管生態(tài)或適應(yīng)性差異可能導(dǎo)致物種多樣性［17］,但通常認(rèn)為分子水平上的基因組進(jìn)化是物種形成的初始起點(diǎn)及物種多樣性的主要驅(qū)動力［18］。宿主或氣候等因素導(dǎo)致SBV 呈現(xiàn)出遺傳多樣性［3,10］,體現(xiàn)在分子水平上的是有地域特征的基因組點(diǎn)突變模式、多聚蛋白基因特定位點(diǎn)的核苷酸插入 ／ 缺失及基因重組等［3,6,8,10］。在多聚蛋白基因核苷酸插入 ／缺失中,第1 段是位于結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因上的連續(xù)核苷酸插入 ／ 缺失,第2 段位于非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因上的是3 個不連續(xù)的核苷酸插入 ／ 缺失［8］,在3株AmSBV-YN 中,僅發(fā)現(xiàn)在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因中存在3 個不連續(xù)的核苷酸插入 ／ 缺失。2014 年,ROBERTS 等［10］報(bào)道了 AmSBV-Npg_KJ629183 全基因組序列,與已公布基因組的SBV 序列的同源性為91% ～93%,未發(fā)現(xiàn)與其他毒株發(fā)生重組,在基因組水平的進(jìn)化樹上與其他西方基因型毒株進(jìn)化距離較遠(yuǎn),認(rèn)為是不同于以往研究的SBV,稱其為新幾內(nèi)亞血清型。本研究采用RT-PCR 方法從自然感染的云南西方蜜蜂幼蟲樣本中擴(kuò)增到占基因組97%的AmSBV-Chn 序列——AmSBV-YN,該序列包含完整的多聚蛋白基因,與已知SBV 序列的同源性為91%～93%,經(jīng) RDP4 分析,除與 AmSBV-Kor_KP296800 在5′端可能發(fā)生重組外,未發(fā)現(xiàn)與其他SBV 毒株發(fā)生重組。利用超基因組97%的多聚蛋白基因?qū)BV 進(jìn)行分子進(jìn)化分析,顯示3 株AmSBV-YN 單獨(dú)構(gòu)成新基因型。因此,AmSBV-YN 為新發(fā)現(xiàn)的SBV 毒株。

由于RdRp 的易錯性,SBV 等蜜蜂RNA 病毒是高突變性病毒［10］,這導(dǎo)致通過RT-PCR 方法從感染樣本中擴(kuò)增SBV 基因組會很困難,數(shù)據(jù)庫中可利用的SBV 基因組不多,對SBV 的分子進(jìn)化分析主要依賴于基因組片段［3,19-20］。由于 RdRp 基因相對保守［3］,研究SBV 的分子進(jìn)化關(guān)系更多是利用該基因。在前期研究中,一般不控制不同基因型內(nèi)SBV 的毒株數(shù)量,這會增加進(jìn)化樹中的節(jié)點(diǎn)數(shù),影響進(jìn)化樹上反映的進(jìn)化關(guān)系［17］。為更準(zhǔn)確地確定AmSBV-YN 與其他AmSBV-Chn 的進(jìn)化關(guān)系,本研究以節(jié)點(diǎn)bootstrap值大于50%為基準(zhǔn)選擇序列［18］,減少了亞洲基因型的毒株數(shù)量,使亞洲基因型、西方基因型及包括AmSBV-YN 在內(nèi)的AmSBV-Chn 的毒株數(shù)量基本相當(dāng),基于RdRp 基因構(gòu)建了SBV 進(jìn)化樹。經(jīng)分析,AmSBV 主要分為西方及亞洲基因型,其中AmSBVYN 與已報(bào)道的AmSBV-Chn 聚集在一起構(gòu)成1 個新基因型。由此推測AmSBV-YN 可能是AmSBVChn 的代表株。

本研究全面展示了AmSBV-YN 的分子特性及SBV 遺傳多樣性,為進(jìn)一步研究SBV 與宿主的相互作用奠定了基礎(chǔ)。