馬慶慶

(貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州 遵義 563000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高居前列，多數(shù)患者確診時已處于晚期，沿用傳統(tǒng)治療方案并未顯著延遲患者生存期[1-5]。腫瘤免疫治療是目前腫瘤研究的新思路，樹突細胞(dendritic cells,DC)是抗原提呈細胞(Antigen Presenting cell,APC)，可激發(fā)機體T細胞應答，在機體抗腫瘤免疫應答中發(fā)揮著重要作用[6]；細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)兼具T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤的特點[7-8]，DC和CIK細胞體外聯(lián)合培養(yǎng)具有強大的抗腫瘤作用。本研究以人肺癌細胞抗原致敏的DC誘導出特異性CIK細胞(DC-CIK)，探討DC-CIK細胞對肺癌細胞的體外殺傷作用，同時測定細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平，旨在為肺癌的特異性細胞免疫治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取健康體檢者20例，性別、年齡隨機分布。排除標準：①肺結(jié)核、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物等患者；②孕婦或哺乳期婦女；③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器：流式細胞分析儀(Beckman Coulter，美國)，血細胞分離機(Fresenius，德國)，CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，臺式低速大容量離心機(湘儀，中國)。

1.2.2主要試劑：Ficoll-人淋巴細胞分離液(Solarbio，中國)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，重組細胞因子(IFN-γ、TFN-α、GM-CSF、IL-4、IL-2)(Pepro Tech，美國)，Anti-CD3McAb(北京同立海源生物，中國)，檢測T細胞亞群各種抗體(Beckman Coulter，美國)，CCK-8試劑盒(碧云天生物，中國)，ELISA試劑盒(R&D systems，美國)，人肺癌A549細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，中國)。

1.3方法

1.3.1效應細胞分組：將效應細胞分為三組:A組為肺癌A549細胞抗原致敏的DC-CIK細胞，B組為未致敏的DC-CIK細胞，C組為單純CIK細胞。

1.3.2肺癌A549細胞抗原制備:將人肺癌A549細胞株加入含10%滅活胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對數(shù)期細胞制細胞懸液，反復凍融3次，低溫超聲破碎，離心收集上清液，過濾滅菌(孔徑0.22 μm)，-80℃保存。

1.3.3DC和CIK 細胞誘導培養(yǎng)：健康成人外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離單個核細胞(PBMC)，37 ℃、5% CO2RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后收集懸浮細胞(用于CIK 細胞培養(yǎng))，加入1 000 U/ml IFN-γ、500 U/ml IL-2、500 ng/ml Anti-CD3McAb 于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)；而貼壁細胞(用于DC誘導培養(yǎng))加入1 000 U/ml GM-CSF、1 000 U/ml IL-4、1 000 U/ml TNF-α于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.3.4肺癌抗原致敏DC-CIK細胞培養(yǎng)：DC 誘導培養(yǎng)第6天加入1.3.2制備的腫瘤抗原，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，第8天收集肺癌A549細胞抗原致敏DC、未致敏DC，按DC∶CIK = 1∶10 比例將DC按實驗分組分別與CIK 細胞混合共培養(yǎng)。

1.3.5細胞免疫表型檢測:收集DC、CIK細胞，PBS細胞懸液加入FITC 標記的上述鼠抗人單抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測DC(第0天、第8天)、CIK 細胞(第0天、第14天)的免疫表型。

1.3.6細胞殺傷活性的檢測：以CCK-8 比色法檢測對照組不同效應細胞對靶細胞肺癌A549的殺傷活性。效靶比依次為15∶1、25∶1、50∶1，按實驗分組鋪板，設(shè)3個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，每孔取5 μl上清加CCK-8 溶液，孵育4 h，用酶標儀在450 nm 波長測量各孔OD值。殺傷活性(%)=[1-(實驗孔OD值-效應細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值]× 100%

1.3.7細胞因子分泌水平測定:以ELISA法檢測對照組不同效應細胞因子的分泌水平。取1.3.6未加CCK-8溶液的10 μl上清液，按R&D systems ELISA 試劑盒說明書測IL-12和IFN-γ細胞因子的分泌水平。

2 結(jié)果

2.1細胞形態(tài)及免疫表型：PMBC常規(guī)培養(yǎng)后，懸浮細胞誘導培養(yǎng)3d后，成熟CIK細胞呈圓形，胞體飽滿透亮，聚集成細胞團狀，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加細胞團增大；貼壁細胞誘導培養(yǎng)7d，單個圓形細胞隨培養(yǎng)天數(shù)增加不斷增大，DC細胞成熟后表面具樹突狀突起。

流式細胞儀檢測細胞免疫表型發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間增加，細胞表型CD3+CD8+的表達持續(xù)增高。培養(yǎng)14 d后，流式細胞檢測結(jié)果顯示：A組(Ag-DC-CIK)CD3+CD8+表達最高(80.2%)，B組(DC-CIK)、C組(CIK)CD3+CD8+表達分別為68.5%、53.3%。

2.2肺癌細胞殺傷活性測定：三組效應細胞培養(yǎng)至14 d，對肺癌A549細胞殺傷活性進行檢測，結(jié)果顯示各組效應細胞都隨著效靶比的增高殺傷力增強，A組(Ag-DC-CIK)效應細胞在不同效靶比較B組(DC-CIK)和C組(CIK)都具更強殺傷能力(P<0.05)，見表1。

表1 各組效應細胞殺傷活性比較

2.3細胞因子分泌水平測定:當效靶比為50∶1時，各組效應細胞對肺癌A549細胞殺傷活性最強，同時測定其細胞因子分泌水平。各組細胞在抑制肺癌細胞的同時，細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌都有所增加，A組IL-12、IFN-γ的分泌水平較B組和C組更高(P<0.05)，見表2。

表2 各組效應細胞因子分泌水平比較

3 討論

近年來，腫瘤相關(guān)研究中免疫治療是一個重要的新研究方向，抗原沖擊的DC可激發(fā)機體的抗原特異性T細胞反應，增強CIK細胞的細胞毒作用[6]；CIK細胞的增殖效率和殺瘤活性較高[7-8]，研究表明CIK細胞能增強肺癌患者免疫功能，提高生存率[9-10]，現(xiàn)已應用于不少腫瘤的臨床治療中。大量研究已證實DC負載自體腫瘤抗原與CIK細胞共培養(yǎng)后可誘導機體產(chǎn)生更強特異性抗腫瘤免疫效應，在腎癌、乳腺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、食管癌、黑色素瘤等腫瘤研究中取得較好療效[11-14]。

本研究用人肺癌A549細胞抗原致敏的DC與同源CIK細胞共培養(yǎng)，對靶細胞肺癌A549細胞進行體外殺傷活性檢測，探討抗原致敏CD-CIK細胞對肺癌細胞的殺傷作用，同時測定細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。流式細胞術(shù)測定免疫細胞表型，結(jié)果顯示肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組具殺傷活性的CD3+CD8+細胞占比最高(P<0.05)，與既往研究相符。體外肺癌細胞殺傷實驗中，在效靶比(15∶1)～(50∶1)范圍內(nèi)，隨著效靶比的增高細胞殺傷活性增強，肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組在不同效靶比具更強殺傷能力，且隨著效靶比的升高殺傷能力增強(P<0.05)。細胞因子IL-12和IFN-γ是具有多重生物活性的抗腫瘤細胞因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，測定三組效應細胞的IL-12和IFN-γ分泌水平，肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組細胞因子IL-12和IFN-γ分泌水平最高(P<0.05)。結(jié)果證實肺癌抗原致敏DC-CIK細胞可增強抗肺癌免疫應答，提高CIK細胞特異性殺傷肺癌細胞能力。

因此，本研究通過對比肺癌抗原致敏DC-CIK、未致敏DC-CIK和CIK細胞在肺癌殺傷作用，同時測定具抗腫瘤活性的細胞因子分泌水平，初步探究抗原致敏DC-CIK細胞對肺癌細胞具有較強殺傷作用，為肺癌免疫治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后續(xù)臨床研究提供參考。