馬慶慶

(貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高居前列，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，沿用傳統(tǒng)治療方案并未顯著延遲患者生存期[1-5]。腫瘤免疫治療是目前腫瘤研究的新思路，樹突細(xì)胞(dendritic cells,DC)是抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting cell,APC)，可激發(fā)機(jī)體T細(xì)胞應(yīng)答，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[6]；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIK)兼具T細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤的特點(diǎn)[7-8]，DC和CIK細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用。本研究以人肺癌細(xì)胞抗原致敏的DC誘導(dǎo)出特異性CIK細(xì)胞(DC-CIK)，探討DC-CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的體外殺傷作用，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平，旨在為肺癌的特異性細(xì)胞免疫治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取健康體檢者20例，性別、年齡隨機(jī)分布。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺結(jié)核、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物等患者；②孕婦或哺乳期婦女；③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器：流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter，美國(guó))，血細(xì)胞分離機(jī)(Fresenius，德國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(湘儀，中國(guó))。

1.2.2主要試劑：Ficoll-人淋巴細(xì)胞分離液(Solarbio，中國(guó))，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胎牛血清(Gibco，美國(guó))，重組細(xì)胞因子(IFN-γ、TFN-α、GM-CSF、IL-4、IL-2)(Pepro Tech，美國(guó))，Anti-CD3McAb(北京同立海源生物，中國(guó))，檢測(cè)T細(xì)胞亞群各種抗體(Beckman Coulter，美國(guó))，CCK-8試劑盒(碧云天生物，中國(guó))，ELISA試劑盒(R&D systems，美國(guó))，人肺癌A549細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，中國(guó))。

1.3方法

1.3.1效應(yīng)細(xì)胞分組：將效應(yīng)細(xì)胞分為三組:A組為肺癌A549細(xì)胞抗原致敏的DC-CIK細(xì)胞，B組為未致敏的DC-CIK細(xì)胞，C組為單純CIK細(xì)胞。

1.3.2肺癌A549細(xì)胞抗原制備:將人肺癌A549細(xì)胞株加入含10%滅活胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)數(shù)期細(xì)胞制細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次，低溫超聲破碎，離心收集上清液，過(guò)濾滅菌(孔徑0.22 μm)，-80℃保存。

1.3.3DC和CIK 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)：健康成人外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，37 ℃、5% CO2RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后收集懸浮細(xì)胞(用于CIK 細(xì)胞培養(yǎng))，加入1 000 U/ml IFN-γ、500 U/ml IL-2、500 ng/ml Anti-CD3McAb 于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)；而貼壁細(xì)胞(用于DC誘導(dǎo)培養(yǎng))加入1 000 U/ml GM-CSF、1 000 U/ml IL-4、1 000 U/ml TNF-α于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.3.4肺癌抗原致敏DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)：DC 誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天加入1.3.2制備的腫瘤抗原，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，第8天收集肺癌A549細(xì)胞抗原致敏DC、未致敏DC，按DC∶CIK = 1∶10 比例將DC按實(shí)驗(yàn)分組分別與CIK 細(xì)胞混合共培養(yǎng)。

1.3.5細(xì)胞免疫表型檢測(cè):收集DC、CIK細(xì)胞，PBS細(xì)胞懸液加入FITC 標(biāo)記的上述鼠抗人單抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC(第0天、第8天)、CIK 細(xì)胞(第0天、第14天)的免疫表型。

1.3.6細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)：以CCK-8 比色法檢測(cè)對(duì)照組不同效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞肺癌A549的殺傷活性。效靶比依次為15∶1、25∶1、50∶1，按實(shí)驗(yàn)分組鋪板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，每孔取5 μl上清加CCK-8 溶液，孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔OD值。殺傷活性(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值]× 100%

1.3.7細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定:以ELISA法檢測(cè)對(duì)照組不同效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌水平。取1.3.6未加CCK-8溶液的10 μl上清液，按R&D systems ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子的分泌水平。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)及免疫表型：PMBC常規(guī)培養(yǎng)后，懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后，成熟CIK細(xì)胞呈圓形，胞體飽滿透亮，聚集成細(xì)胞團(tuán)狀，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加細(xì)胞團(tuán)增大；貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，單個(gè)圓形細(xì)胞隨培養(yǎng)天數(shù)增加不斷增大，DC細(xì)胞成熟后表面具樹突狀突起。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞表型CD3+CD8+的表達(dá)持續(xù)增高。培養(yǎng)14 d后，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：A組(Ag-DC-CIK)CD3+CD8+表達(dá)最高(80.2%)，B組(DC-CIK)、C組(CIK)CD3+CD8+表達(dá)分別為68.5%、53.3%。

2.2肺癌細(xì)胞殺傷活性測(cè)定：三組效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)至14 d，對(duì)肺癌A549細(xì)胞殺傷活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示各組效應(yīng)細(xì)胞都隨著效靶比的增高殺傷力增強(qiáng)，A組(Ag-DC-CIK)效應(yīng)細(xì)胞在不同效靶比較B組(DC-CIK)和C組(CIK)都具更強(qiáng)殺傷能力(P<0.05)，見表1。

表1 各組效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性比較

2.3細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定:當(dāng)效靶比為50∶1時(shí)，各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)肺癌A549細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，同時(shí)測(cè)定其細(xì)胞因子分泌水平。各組細(xì)胞在抑制肺癌細(xì)胞的同時(shí)，細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的分泌都有所增加，A組IL-12、IFN-γ的分泌水平較B組和C組更高(P<0.05)，見表2。

表2 各組效應(yīng)細(xì)胞因子分泌水平比較

3 討論

近年來(lái)，腫瘤相關(guān)研究中免疫治療是一個(gè)重要的新研究方向，抗原沖擊的DC可激發(fā)機(jī)體的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[6]；CIK細(xì)胞的增殖效率和殺瘤活性較高[7-8]，研究表明CIK細(xì)胞能增強(qiáng)肺癌患者免疫功能，提高生存率[9-10]，現(xiàn)已應(yīng)用于不少腫瘤的臨床治療中。大量研究已證實(shí)DC負(fù)載自體腫瘤抗原與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)，在腎癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肝癌、食管癌、黑色素瘤等腫瘤研究中取得較好療效[11-14]。

本研究用人肺癌A549細(xì)胞抗原致敏的DC與同源CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)靶細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷活性檢測(cè)，探討抗原致敏CD-CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定免疫細(xì)胞表型，結(jié)果顯示肺癌抗原致敏DC-CIK細(xì)胞組具殺傷活性的CD3+CD8+細(xì)胞占比最高(P<0.05)，與既往研究相符。體外肺癌細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，在效靶比(15∶1)～(50∶1)范圍內(nèi)，隨著效靶比的增高細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)，肺癌抗原致敏DC-CIK細(xì)胞組在不同效靶比具更強(qiáng)殺傷能力，且隨著效靶比的升高殺傷能力增強(qiáng)(P<0.05)。細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ是具有多重生物活性的抗腫瘤細(xì)胞因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，測(cè)定三組效應(yīng)細(xì)胞的IL-12和IFN-γ分泌水平，肺癌抗原致敏DC-CIK細(xì)胞組細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ分泌水平最高(P<0.05)。結(jié)果證實(shí)肺癌抗原致敏DC-CIK細(xì)胞可增強(qiáng)抗肺癌免疫應(yīng)答，提高CIK細(xì)胞特異性殺傷肺癌細(xì)胞能力。

因此，本研究通過(guò)對(duì)比肺癌抗原致敏DC-CIK、未致敏DC-CIK和CIK細(xì)胞在肺癌殺傷作用，同時(shí)測(cè)定具抗腫瘤活性的細(xì)胞因子分泌水平，初步探究抗原致敏DC-CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)殺傷作用，為肺癌免疫治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后續(xù)臨床研究提供參考。