馬慶慶
(貴州航天醫(yī)院中心實驗室,貴州 遵義 563000)
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率高居前列,多數(shù)患者確診時已處于晚期,沿用傳統(tǒng)治療方案并未顯著延遲患者生存期[1-5]。腫瘤免疫治療是目前腫瘤研究的新思路,樹突細胞(dendritic cells,DC)是抗原提呈細胞(Antigen Presenting cell,APC),可激發(fā)機體T細胞應答,在機體抗腫瘤免疫應答中發(fā)揮著重要作用[6];細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)兼具T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤的特點[7-8],DC和CIK細胞體外聯(lián)合培養(yǎng)具有強大的抗腫瘤作用。本研究以人肺癌細胞抗原致敏的DC誘導出特異性CIK細胞(DC-CIK),探討DC-CIK細胞對肺癌細胞的體外殺傷作用,同時測定細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平,旨在為肺癌的特異性細胞免疫治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。
1.1一般資料:選取健康體檢者20例,性別、年齡隨機分布。排除標準:①肺結(jié)核、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物等患者;②孕婦或哺乳期婦女;③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。
1.2儀器與試劑
1.2.1主要儀器:流式細胞分析儀(Beckman Coulter,美國),血細胞分離機(Fresenius,德國),CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國),倒置顯微鏡(Olympus,日本),臺式低速大容量離心機(湘儀,中國)。
1.2.2主要試劑:Ficoll-人淋巴細胞分離液(Solarbio,中國),RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),胎牛血清(Gibco,美國),重組細胞因子(IFN-γ、TFN-α、GM-CSF、IL-4、IL-2)(Pepro Tech,美國),Anti-CD3McAb(北京同立海源生物,中國),檢測T細胞亞群各種抗體(Beckman Coulter,美國),CCK-8試劑盒(碧云天生物,中國),ELISA試劑盒(R&D systems,美國),人肺癌A549細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,中國)。
1.3方法
1.3.1效應細胞分組:將效應細胞分為三組:A組為肺癌A549細胞抗原致敏的DC-CIK細胞,B組為未致敏的DC-CIK細胞,C組為單純CIK細胞。
1.3.2肺癌A549細胞抗原制備:將人肺癌A549細胞株加入含10%滅活胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),對數(shù)期細胞制細胞懸液,反復凍融3次,低溫超聲破碎,離心收集上清液,過濾滅菌(孔徑0.22 μm),-80℃保存。
1.3.3DC和CIK 細胞誘導培養(yǎng):健康成人外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離單個核細胞(PBMC),37 ℃、5% CO2RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后收集懸浮細胞(用于CIK 細胞培養(yǎng)),加入1 000 U/ml IFN-γ、500 U/ml IL-2、500 ng/ml Anti-CD3McAb 于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng);而貼壁細胞(用于DC誘導培養(yǎng))加入1 000 U/ml GM-CSF、1 000 U/ml IL-4、1 000 U/ml TNF-α于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。
1.3.4肺癌抗原致敏DC-CIK細胞培養(yǎng):DC 誘導培養(yǎng)第6天加入1.3.2制備的腫瘤抗原,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),第8天收集肺癌A549細胞抗原致敏DC、未致敏DC,按DC∶CIK = 1∶10 比例將DC按實驗分組分別與CIK 細胞混合共培養(yǎng)。
1.3.5細胞免疫表型檢測:收集DC、CIK細胞,PBS細胞懸液加入FITC 標記的上述鼠抗人單抗,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗滌2次,流式細胞儀檢測DC(第0天、第8天)、CIK 細胞(第0天、第14天)的免疫表型。
1.3.6細胞殺傷活性的檢測:以CCK-8 比色法檢測對照組不同效應細胞對靶細胞肺癌A549的殺傷活性。效靶比依次為15∶1、25∶1、50∶1,按實驗分組鋪板,設(shè)3個復孔,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h,每孔取5 μl上清加CCK-8 溶液,孵育4 h,用酶標儀在450 nm 波長測量各孔OD值。殺傷活性(%)=[1-(實驗孔OD值-效應細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值]× 100%
1.3.7細胞因子分泌水平測定:以ELISA法檢測對照組不同效應細胞因子的分泌水平。取1.3.6未加CCK-8溶液的10 μl上清液,按R&D systems ELISA 試劑盒說明書測IL-12和IFN-γ細胞因子的分泌水平。
2.1細胞形態(tài)及免疫表型:PMBC常規(guī)培養(yǎng)后,懸浮細胞誘導培養(yǎng)3d后,成熟CIK細胞呈圓形,胞體飽滿透亮,聚集成細胞團狀,隨著培養(yǎng)天數(shù)增加細胞團增大;貼壁細胞誘導培養(yǎng)7d,單個圓形細胞隨培養(yǎng)天數(shù)增加不斷增大,DC細胞成熟后表面具樹突狀突起。
流式細胞儀檢測細胞免疫表型發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間增加,細胞表型CD3+CD8+的表達持續(xù)增高。培養(yǎng)14 d后,流式細胞檢測結(jié)果顯示:A組(Ag-DC-CIK)CD3+CD8+表達最高(80.2%),B組(DC-CIK)、C組(CIK)CD3+CD8+表達分別為68.5%、53.3%。
2.2肺癌細胞殺傷活性測定:三組效應細胞培養(yǎng)至14 d,對肺癌A549細胞殺傷活性進行檢測,結(jié)果顯示各組效應細胞都隨著效靶比的增高殺傷力增強,A組(Ag-DC-CIK)效應細胞在不同效靶比較B組(DC-CIK)和C組(CIK)都具更強殺傷能力(P<0.05),見表1。
表1 各組效應細胞殺傷活性比較
2.3細胞因子分泌水平測定:當效靶比為50∶1時,各組效應細胞對肺癌A549細胞殺傷活性最強,同時測定其細胞因子分泌水平。各組細胞在抑制肺癌細胞的同時,細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌都有所增加,A組IL-12、IFN-γ的分泌水平較B組和C組更高(P<0.05),見表2。
表2 各組效應細胞因子分泌水平比較
近年來,腫瘤相關(guān)研究中免疫治療是一個重要的新研究方向,抗原沖擊的DC可激發(fā)機體的抗原特異性T細胞反應,增強CIK細胞的細胞毒作用[6];CIK細胞的增殖效率和殺瘤活性較高[7-8],研究表明CIK細胞能增強肺癌患者免疫功能,提高生存率[9-10],現(xiàn)已應用于不少腫瘤的臨床治療中。大量研究已證實DC負載自體腫瘤抗原與CIK細胞共培養(yǎng)后可誘導機體產(chǎn)生更強特異性抗腫瘤免疫效應,在腎癌、乳腺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、食管癌、黑色素瘤等腫瘤研究中取得較好療效[11-14]。
本研究用人肺癌A549細胞抗原致敏的DC與同源CIK細胞共培養(yǎng),對靶細胞肺癌A549細胞進行體外殺傷活性檢測,探討抗原致敏CD-CIK細胞對肺癌細胞的殺傷作用,同時測定細胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。流式細胞術(shù)測定免疫細胞表型,結(jié)果顯示肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組具殺傷活性的CD3+CD8+細胞占比最高(P<0.05),與既往研究相符。體外肺癌細胞殺傷實驗中,在效靶比(15∶1)~(50∶1)范圍內(nèi),隨著效靶比的增高細胞殺傷活性增強,肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組在不同效靶比具更強殺傷能力,且隨著效靶比的升高殺傷能力增強(P<0.05)。細胞因子IL-12和IFN-γ是具有多重生物活性的抗腫瘤細胞因子,具有多種免疫調(diào)節(jié)功能,測定三組效應細胞的IL-12和IFN-γ分泌水平,肺癌抗原致敏DC-CIK細胞組細胞因子IL-12和IFN-γ分泌水平最高(P<0.05)。結(jié)果證實肺癌抗原致敏DC-CIK細胞可增強抗肺癌免疫應答,提高CIK細胞特異性殺傷肺癌細胞能力。
因此,本研究通過對比肺癌抗原致敏DC-CIK、未致敏DC-CIK和CIK細胞在肺癌殺傷作用,同時測定具抗腫瘤活性的細胞因子分泌水平,初步探究抗原致敏DC-CIK細胞對肺癌細胞具有較強殺傷作用,為肺癌免疫治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為后續(xù)臨床研究提供參考。