■鐘 浪 孫金梅 張振偉 吳慶俠 董海龍 楊 飛* 曾江勇 馬宏財(cái)

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩850000）

牦牛有著“高原之舟”之稱，是西藏高原地區(qū)最具特色的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，而犢牦牛腹瀉病是牦牛養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的疾病之一[1]，其輕度癥狀表現(xiàn)為腹瀉、食欲不振、精神萎靡、高熱、咳嗽等[2]；重度癥狀表現(xiàn)為機(jī)體脫水、便血、電解質(zhì)平衡紊亂，甚至引起犢牦牛死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)影響較大。由于藏區(qū)牧民養(yǎng)殖技術(shù)整體落后，對(duì)該病的治療多以抗生素為主，這導(dǎo)致該病的耐藥性十分嚴(yán)重[3]。因此，尋找抗生素的替代藥物十分迫切。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis)為芽孢桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)腸球菌科(Enterococ?caceae)腸球菌屬（Enterococcus)的兼性厭氧菌，是一種廣泛存在于動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌群，對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境具有重要作用[4]。其調(diào)節(jié)腸道菌群的功能主要體現(xiàn)在可調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)，提高家畜抗病性、生產(chǎn)性能[5]等，同時(shí)具有無殘留、無污染和無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[6]。目前被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療健康[6]、食品安全[7]等方面，分別于2008、2013、2018年被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部收錄在《飼料添加劑品種目錄》內(nèi)。有研究表明，優(yōu)良的糞腸球菌菌株主要來源于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)[8]，能快速定植并耐受胃腸道的復(fù)雜環(huán)境以發(fā)揮益生作用[9]。

本研究擬從健康牦牛的腸道內(nèi)容物中分離純化、篩選出具有防治犢牦牛腹瀉病的糞腸球菌菌株，對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過抑菌試驗(yàn)、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分離株對(duì)犢牦牛腹瀉性疾病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

糞腸球菌（E.faecalis）S-5：由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)重點(diǎn)臨床實(shí)驗(yàn)室分離自健康牦牛糞便，現(xiàn)保存于-80℃冰箱中。

抑菌試驗(yàn)指示菌株：大腸桿菌O111菌株、大腸桿菌O78菌株購自西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防實(shí)驗(yàn)室；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；表皮葡萄球菌由西藏農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)重點(diǎn)臨床實(shí)驗(yàn)室分離所得。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物健康犢牦牛4頭，4～6月齡購自西藏林芝市巴宜區(qū)百巴鎮(zhèn)色貢村永珠羅布藏牦牛養(yǎng)殖合作社。

1.1.3 培養(yǎng)基

糞腸球菌固體培養(yǎng)基（規(guī)格250 g/瓶）、糞腸球菌液體培養(yǎng)基（規(guī)格250 g/瓶），購自凡科維(上海)科技有限公司。

1.1.4 藥品試劑

成套糞腸球菌生化鑒定管，購自青島海博生物有限公司；胰蛋白酶，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；牛膽鹽，購自杭州寶積生物科技有限公司。

1.1.5 設(shè)備

BAC-GZT-B01超凈工作臺(tái)購自廣州佰倫凈化設(shè)備制造有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱購自金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；BXM-30R高壓蒸汽滅菌器購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-230SDCY超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS高速冷凍離心機(jī)購自金壇市鴻科儀器廠；AZ-8685 pH計(jì)購自臺(tái)灣衡欣有限公司；Thermo Sci?entific?Multiskan?FC酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將凍存于-80℃冰箱的糞腸球菌S-5的凍存管取出，凍存管恢復(fù)室溫后接種于糞腸球菌固體培養(yǎng)基活化24 h后，轉(zhuǎn)接于糞腸球菌液體培養(yǎng)基，接種后總體積為10 mL(1 mL+9 mL)，于37℃下培養(yǎng)24 h獲得活化菌株，最后使用平板稀釋計(jì)數(shù)法記錄細(xì)菌活化數(shù)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定及溶血性分析

將所得疑似菌株做革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡100×油鏡下檢查并拍照記錄。使用新鮮綿羊血液制作哥倫比亞血平板，并接種所得疑似菌株，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察并拍照記錄。

1.2.3 生化鑒定

生化鑒定使用青島海博生物有限公司所生產(chǎn)的糞腸球菌生化鑒定管進(jìn)行生化鑒定。參照其使用說明書對(duì)照鑒定結(jié)果。

1.2.4 耐受性試驗(yàn)

耐膽鹽試驗(yàn)：取復(fù)蘇菌株0.1 mL，分別接種至已滅菌的含有牛膽鹽溶液（0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL）的選擇培養(yǎng)基中，37℃、無氧條件下培養(yǎng)24 h，24 h后使用平板稀釋計(jì)數(shù)法記錄細(xì)菌存活數(shù)并以不加膽鹽培養(yǎng)的細(xì)菌活菌數(shù)為指標(biāo)計(jì)算各膽鹽濃度下細(xì)菌的活菌率。計(jì)算公式如下：細(xì)菌存活率（%）=（不同膽鹽濃度下的細(xì)菌存活數(shù)/空白對(duì)照組細(xì)菌存活數(shù)）×100。

胰蛋白酶的耐受性試驗(yàn)：將復(fù)蘇細(xì)菌離心以收集菌體，用糞腸球菌液體培養(yǎng)基重懸至108CFU/mL，加入0.5%、1.0%、1.3%、1.6%、1.9%不同濃度的胰蛋白酶溶液中，37℃無氧條件下培養(yǎng)24 h；24 h后使用平板稀釋計(jì)數(shù)法記錄細(xì)菌存活數(shù)，并計(jì)算細(xì)菌存活率，計(jì)算公式如下：細(xì)菌存活率（%）=（不同胰蛋白酶濃度下的細(xì)菌存活數(shù)/108CFU/mL）×100。

耐酸試驗(yàn)：將復(fù)蘇細(xì)菌離心以收集菌體，將滅菌后的糞腸球菌液體培養(yǎng)基pH調(diào)成(4.3、5.2、6.5、8.2和8.7)，37℃培養(yǎng)1 h后涂布于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基于37℃無氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 h，記錄生長狀況。

1.2.5 體外抑菌試驗(yàn)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別涂布20μL大腸桿菌O111、O78標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，后將已滅菌的牛津杯置于各培養(yǎng)基表面。最后抽取糞腸球菌純化液200μL轉(zhuǎn)移至牛津杯內(nèi)，37℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)量其抑菌圈直徑。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定

PCR凝膠電泳試驗(yàn)：選取耐受性及抑菌效果最好的一株分離菌使用EZUP DNA抽提取試劑盒提取純化菌株DNA并利用引物對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，模板DNA（20～50 ng/μL）0.5μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5μL，Dntp(各2.5 mmoL/L)1μL，酶0.2μL；F(10 Um)0.5μL，R(10 Um)0.2μL，ddH2O 25μL。熱循環(huán)儀中，反應(yīng)按94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。

配置1.7%的凝膠塊，使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將上述所得疑似糞腸球菌菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。

16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析：利用BLAST網(wǎng)站、Gen Bank數(shù)據(jù)庫對(duì)所得測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用MEGA 7軟件進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析。

1.2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將4頭犢牦牛隨機(jī)分為2組，第一組標(biāo)記為1、2號(hào)，第二組標(biāo)記為3、4號(hào)，并分別使用大腸桿菌O111、O78標(biāo)準(zhǔn)株以含量為1×1010CFU/mL[10]每日灌服犢牦牛3次攻毒，灌服5～7日，直至出現(xiàn)典型的腹瀉癥狀后，使用含量為1×1010CFU/mL的糞腸球菌進(jìn)行灌服治療，觀察并記錄犢牦牛臨床癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株活化

分離株S-5成功活化，該活化濃度為6.65×1010CFU/mL。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定及溶血性分析結(jié)果

由圖1～圖3可知，該分離株在普通糞腸球菌固體培養(yǎng)基上該菌落呈圓形、白色，菌落表面濕潤有光澤，其革蘭氏染色100×油鏡鏡檢呈紫色陽性球菌，菌落直徑為1.28～2.21μm，見圖1、圖2。將5株菌株接種于哥倫比亞血平板，菌落呈圓形、白色，菌落表面濕潤有光澤，S-5無明顯溶血環(huán)，但其菌落周圍變?yōu)楹谏?/p>

圖1 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基

圖2 革蘭氏100×油鏡

圖3 哥倫比亞血平板

2.3 生化鑒定（見表1）

由表1可知，在生化鑒定中，分離株S-5革蘭氏染色呈陽性，能分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖等、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解甘露醇、棉籽糖，在硫化氫、硝酸鹽、吲哚試驗(yàn)中呈陰性，且血凝試驗(yàn)中不發(fā)生凝血反應(yīng)，見表1。

2.4 耐受性試驗(yàn)

2.4.1 耐膽鹽試驗(yàn)（見表2）

由表2可知，在耐膽鹽試驗(yàn)中，S-5菌株隨膽鹽濃度上升存活率不斷下降，經(jīng)F檢驗(yàn)分析顯示，當(dāng)膽鹽濃度為0.03～0.15 g/100 mL時(shí)，分離株S-5耐受性呈顯著(P＜0.05)差異，當(dāng)膽鹽濃度為0.20～0.30 g/100 mL時(shí)，分離株S-5耐受性呈極顯著(P＜0.01)差異。

表1 分離株生理生化鑒定結(jié)果

表2 分離株在不同濃度的牛膽鹽溶液中的存活率（%）

2.4.2 耐胰蛋白酶液的試驗(yàn)（見表3）

由表3可知，當(dāng)胰蛋白酶濃度為0.5%～1.3%時(shí)，S-5耐受性具佳，經(jīng)F檢驗(yàn)分析顯示呈極顯著性(P＜0.01)差異；當(dāng)胰蛋白酶濃度為1.6%～1.9%時(shí)，S-5耐受性較佳，經(jīng)F檢驗(yàn)分析顯示呈顯著性(P＜0.05)差異。2.4.3 耐酸試驗(yàn)（見圖4）

表3 分離株在不同濃度的胰蛋白酶液下的存活率（%）

圖4 S-5在不同pH培養(yǎng)基中的生長情況

由圖4可知，S-5在pH為4.3、5.2、6.5時(shí)生長性能具佳。

2.5 體外抑菌試驗(yàn)（見圖5和表4）

圖5 部分體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由圖5、表4可知，體外抑菌試驗(yàn)證明，糞腸球菌S-5對(duì)大腸桿菌O111、O78皆有較好的抑菌效果，抑菌圈平均直徑分別為(17.00±1.00)、(20.00±1.00)mm；經(jīng)F檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)表明，糞腸球菌S-5對(duì)大腸桿菌O111、O78抑菌效果呈顯著性（P＜0.05）差異；對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌皆無抑菌性，呈極顯著性（P＜0.01）差異。

表4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果（mm）

2.6 分子生物學(xué)鑒定

2.6.1 PCR凝膠電泳試驗(yàn)（見圖6）

圖6可知，本次凝膠電泳所使用的為細(xì)菌鑒定通用引物，長度為1 500 bp左右，分離株S-5在凝膠成像分析儀上觀察位置，目的條帶處于Marker的1 500 bp左右，符合預(yù)期設(shè)定。

2.6.2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性分析（見圖7、圖8）

由圖7、圖8可知，經(jīng)16SrDNA測(cè)序后利用NCBI在線軟件對(duì)16SrDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示該分離株S-5 16S測(cè)序長度為1 427 bp，經(jīng)同源性對(duì)比知其與糞腸球菌gp117、M-26染色體基因組有98.8%的相似；與糞腸球菌TBT2 SRLFDA 2016染色體基因組有98.3%的相似，即確定該分離株S-5為糞腸球菌菌屬，見圖7。經(jīng)計(jì)算，本試驗(yàn)所得S-5序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已知桿菌屬序列的種內(nèi)遺傳距離為0，分離株S-5與糞腸球菌KM495947.1、KY348704.1劃為同一分支。

圖6 S-5凝膠電泳圖（1.7%）

圖7 S-5菌株同源性比對(duì)分析

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

攻毒第一日，4頭牦牛均正常；攻毒第二日，1、3、4號(hào)牦牛正常，2號(hào)有初期腹瀉表現(xiàn)；攻毒第3 d，4頭犢牦牛均出現(xiàn)水樣腹瀉癥狀；攻毒第4日，4頭犢牦牛依舊呈水樣腹瀉癥狀；攻毒第五日，4頭犢牦牛穩(wěn)定在水樣腹瀉狀態(tài)，并于攻毒第五日開始轉(zhuǎn)用糞腸球菌進(jìn)行治療試驗(yàn)。

治療第一日，4頭牦牛未見恢復(fù)；治療第二日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀逐漸變得良好；治療第三日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀逐漸接近健康；治療第四日，4頭犢牦牛腹瀉癥狀已完全消失。

3 討論

牦牛源糞腸球菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，屬于乳酸菌屬[4]，是乳酸菌屬中為數(shù)不多的條件致病菌[11]。與常見只具備益生功能的乳酸菌不同，糞腸球菌可能同時(shí)具備“益生功能[12]”及“致病功能[13-14]”兩種。前者主要體現(xiàn)為調(diào)節(jié)機(jī)體腸道功能、治療腸道疾病、增加機(jī)體免疫力[15-16]等；后者主要體現(xiàn)在其可感染動(dòng)物機(jī)體的泌尿道、生殖道、口腔、手術(shù)傷口等[17]。

圖8 S-5菌株與參考菌種16S rDNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

因此，本次分離疑似糞腸球菌菌株S-5首先進(jìn)行安全性測(cè)評(píng)，利用哥倫比亞血平板檢測(cè)其是否有溶血功能，結(jié)果顯示S-5菌株不具備溶血性，因此不會(huì)引起菌血癥、敗血癥等疾?。簧囼?yàn)中甘露醇試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)結(jié)果皆呈陰性，表明其不致病，對(duì)比魯旭等[18]的試驗(yàn)結(jié)果，S-5菌株與其生化結(jié)果相似，側(cè)面驗(yàn)證本試驗(yàn)中糞腸球菌不具備致病功能。經(jīng)耐膽鹽、耐胰蛋白酶液及耐酸試驗(yàn)表明S-5菌株耐受效果良好，其中S-5菌株隨其膽鹽濃度上升存活率不斷下降，在不同濃度的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶濃度為0.5%～1.3%時(shí)，S-5耐受性具佳，胰蛋白酶濃度為1.3%～1.9%時(shí)，S-5耐受性較佳；耐酸試驗(yàn)中，pH值較低的情況下（4.3、5.2、6.5）S-5菌株生長性能未受太大影響，綜上所述表明S-5菌株能適應(yīng)胃部的復(fù)雜環(huán)境而進(jìn)入腸道定植。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明S-5菌株對(duì)大腸桿菌類菌株具有良好的抑制效果，但對(duì)葡萄球菌類菌株表現(xiàn)不佳，與陳春艷等[19]所分離的糞腸球菌HEWA223、HEW-A503和HEW-A219對(duì)大腸桿菌的抑菌效果相似；最后對(duì)S-5菌株提取DNA進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析，在凝膠電泳試驗(yàn)過程中，所使用的為糞腸球菌鑒定通用引物，長度為1 500 bp左右，該分離株S-5在凝膠成像分析儀上觀察位置，目的條帶處于Marker的1 500 bp左右，符合預(yù)期設(shè)定，初步斷定其為糞腸球菌屬，在同源性對(duì)比試驗(yàn)中，S-5菌株與糞腸球gp117、M-26染色體基因組98.8%的相似；與糞腸球菌TBT2 SRLFDA 2016染色體基因組98.3%的相似，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上與糞腸球菌KM495947.1、KY348704.1劃為同一分支，其中糞腸球菌KM495947.1是Partovi等[20]于2014年在伊朗地區(qū)從奶酪中分離得到的腸道益生菌群，糞腸球菌KY348704.1是Khodaei等[21]于2017在伊朗地區(qū)從牛奶中分離得到的益生菌群，因此確定該分離株為益生性糞腸球菌。動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示分離株對(duì)大腸桿菌所導(dǎo)致的犢牦牛腹瀉疾病具有良好的治療效果，對(duì)牦牛并未造成致病作用，與Zyl等[22]的對(duì)糞腸球菌的評(píng)論一致，符合預(yù)期效果。

4 結(jié)論

綜上所述，本次分離的糞腸球菌對(duì)大腸桿菌所致的犢牦牛腹瀉疾病具有較強(qiáng)的防治功能，為防治犢牦牛腹瀉疾病所用益生菌制劑提供重要的參考菌源，也為防治犢牦牛腹瀉性疾病提供新思路。