■靳天宇 牛宏澤 胡 宇 任有蛇 石 磊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

硒（Se）是人和動物體所必需的微量元素之一，主要經(jīng)胃腸道吸收后廣泛分布于體內(nèi)各處，參與動物體內(nèi)各種代謝反應(yīng)，具有抗氧化應(yīng)激、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管的作用[1]。除此之外，硒與雄性動物繁殖機(jī)能，尤其是精子的產(chǎn)生也有著密切聯(lián)系[2]。Song等[3]研究表明，硒能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因的表達(dá)量來調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的增殖與凋亡。睪丸和附睪中高濃度的硒通過參與合成各種硒蛋白，直接參與睪酮的合成以及精子的發(fā)生。而缺硒不但會引發(fā)各種疾病，還會嚴(yán)重影響動物的生長性能，導(dǎo)致精子質(zhì)量變差，造成繁殖能力的下降[4]。金海峰等[5]研究表明，在羔羊日糧中添加納米硒能顯著提高精子的頂體完整率，增強(qiáng)精漿中抗氧化酶的活性，從而提高精液品質(zhì)；閆治川等[6]則發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖過程中補(bǔ)硒，能顯著提高波爾山羊的血清硒含量，精子活力也有顯著性提高；施力光等[7]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.5 mg/kg酵母硒，能顯著提高海南黑山羊的精子密度和精子活力，這充分說明了硒對精子的產(chǎn)生和精液的品質(zhì)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。

線粒體是精子最重要的細(xì)胞器，位于精子中段，通過復(fù)雜的氧化磷酸化生成ATP為精子供能。在線粒體呼吸氧化過程中，電子經(jīng)過呼吸鏈的傳遞，在內(nèi)膜兩側(cè)造成了其他離子濃度的傳遞，從而形成了線粒體膜電位，膜電位的高低決定著線粒體的活性，也與精子活力與受精能力密切相關(guān)。但一直以來線粒體在精子生理和病理中的作用卻被忽視。最近的研究指出，線粒體正常的能量代謝是支持精子多種功能的關(guān)鍵因素[8]，而葡萄糖和果糖是其主要的代謝底物和燃料分子。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)是一類調(diào)控胞外葡萄糖進(jìn)入胞內(nèi)的跨膜蛋白，參與精子能量代謝，在調(diào)節(jié)精子能量代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。已知的GLUTs由500個(gè)左右的氨基酸殘基組成[10]，其結(jié)構(gòu)共有14種。GLUTs家族中大部分蛋白都可以轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，已有研究報(bào)道，一些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如GLUT 3、GLUT 8的分布和表達(dá)與精子活力和線粒體功能有關(guān)[11]。因此，本試驗(yàn)通過在綿羊日糧中添加適宜水平的亞硒酸鈉，研究硒對綿羊精液品質(zhì)的影響，并通過檢測精子的線粒體活性和GLUT 3、GLUT 8蛋白的表達(dá)豐度探究硒是否通過調(diào)節(jié)精子能量代謝影響精子活力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧組成

試驗(yàn)在山西省太谷縣保森畜牧有限公司的養(yǎng)殖場內(nèi)進(jìn)行。選取24只（3±0.5）歲，體重相近（38.5±7.5）kg的成年杜泊公羊，隨機(jī)分成2組。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（對照組），試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5 mg/kg亞硒酸鈉的日糧（硒處理組）?；A(chǔ)日糧按照NRC（1985）山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的營養(yǎng)水平設(shè)計(jì)配方，由苜蓿干草、秸稈和精飼料（玉米、豆粕等）組成，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)用羊單欄飼養(yǎng)，每日8：00與16：00各飼喂一次，自由飲水。試驗(yàn)期90 d，預(yù)試期15 d，正試期75 d。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束前兩周，使用假陰道法每周采精2次（隔2 d采精）。采集精液后用保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，取少量樣品檢測精子活力、精子直線運(yùn)動速度（Velocity of Straight-line，VSL）、精子曲線運(yùn)動速度（Velocity of Curvilinear，VCL）、精子平均運(yùn)動速度（Velocity of Av?erage path，VAP）、精子質(zhì)膜完整性和線粒體完整性，剩余樣品2 200 r/min離心10 min，保留沉淀用于GLUTs的豐度檢測與免疫熒光試驗(yàn)。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 精子活力與運(yùn)動參數(shù)

采集精液后立即進(jìn)行精子品質(zhì)檢測，使用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)節(jié)精子濃度至6.0×107個(gè)/mL，取精液10μL滴在預(yù)熱的載玻片上觀察，通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）分析精子活力與運(yùn)動參數(shù)。

1.3.2 精子質(zhì)膜完整性

通過低滲腫脹法（HOST）檢測精子質(zhì)膜是否完整。低滲溶液由1.35 g果糖和0.735 g檸檬酸鈉加入100 mL純化水中配制而成。將精液樣品放入37℃水浴鍋中孵育3 min，吸取10μL精液加入提前預(yù)熱好的離心管中，再加入100μL預(yù)熱好的低滲溶液，水浴鍋中孵育30 min。取10μL混合液涂片，風(fēng)干后于400×顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)以上精子。質(zhì)膜完整率（%）=質(zhì)膜完整的精子/總精子數(shù)×100。

1.3.3 精子的線粒體活性檢測

線粒體活性用線粒體膜電位表示，通過JC-1與PI雙熒光染色法進(jìn)行檢測。從樣品中吸取80μL精液加入提前預(yù)熱好的離心管中后，加入4μL JC-1以及2μL PI染液。避光條件下孵育30 min，然后加入總體積10%的Hancock’s solution溶液，吹打混勻后取3.5μL的混合液于載玻片上，壓片后在400×熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)以上精子。JC-1/PI熒光染色的結(jié)果為：尾部呈橙色熒光的精子為高線粒體膜電位精子；尾部呈綠色熒光的精子為低線粒體膜電位精子。精子線粒體活性（%）=高線粒體活性的精子/精子總數(shù)×100。

1.3.4 GLUTs的表達(dá)檢測

將對照組與硒處理組樣品用生理鹽水2 000 r/min離心清洗3次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)置于冰上裂解30 min，超聲波破碎，4℃、13 000 r/min條件下離心15 min，保留上清蛋白溶液。使用核酸蛋白儀測定蛋白濃度。采用常規(guī)Western Blot方法測定提取蛋白樣品中GLUTs的表達(dá)量水平。取保存的蛋白每管加入20μL樣品緩沖液（精子蛋白∶蛋白樣品緩沖液=4∶1），在100℃條件下變性10 min，每個(gè)樣品的總蛋白上樣量為50μg。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)至NC膜，使用5%的山羊血清室溫封閉1 h，分別加入GLUT3、GLUT8（1∶500）和β-actin（1∶10 000）一抗，4℃孵育過夜。用Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)洗膜3次，每次10 min。加入熒光二抗，避光孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。用Odyssey?CLX雙色近紅外成像系統(tǒng)拍照。使用Image J圖像分析軟件掃描測定灰度值，重復(fù)三次。GLUTs相對豐度=GLUTs灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3.5 免疫熒光檢測GLUTs定位

取適量精液涂抹于黏附性載玻片上自然風(fēng)干，4%多聚甲醛固定20 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，自然風(fēng)干。樣品處滴加5%山羊血清封閉3 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加一抗（1∶150）于4℃濕盒中孵育過夜，PBS清洗3次；樣品處滴加FITC熒光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，封片并在熒光顯微鏡下觀察拍照，每張涂片隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來表示，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的one-way ANOVA方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，差異顯著性水平為P＜0.05。用GraphPad Prism 6.0軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中添加硒對綿羊精液品質(zhì)的影響（見表2）

表2 日糧中添加硒對綿羊精子活力、運(yùn)動參數(shù)的影響

由表2可知，硒處理組綿羊精子的活力和活率均顯著高于對照組（P＜0.05）。經(jīng)由CASA系統(tǒng)分析后，發(fā)現(xiàn)硒處理組精子的VSL、VCL與VAP都顯著高于對照組（P＜0.05）。表明日糧中添加硒能顯著增加綿羊精液的活力與活率，且顯著提高了精子運(yùn)動速度。

2.2 日糧中添加硒對綿羊精子質(zhì)膜完整性及線粒體活性的影響（見圖1）

由圖1可知，硒處理組的質(zhì)膜完整性以及線粒體活性均高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）。表明日糧中添加硒有助于提高精子的質(zhì)膜完整性，也有利于增強(qiáng)精子線粒體的活性。

2.3 日糧中添加硒對綿羊精子GLUTs表達(dá)的影響

通過Western Blot分析對照組與硒處理組綿羊精子中GLUT3、GLUT8蛋白的相對表達(dá)豐度（見圖2），結(jié)果可知，硒處理組與對照組相比，GLUT3、GLUT8蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。

圖1 日糧中添加亞硒酸鈉對綿羊精子質(zhì)膜完整性（a）及線粒體活性(b)的影響

圖2 日糧中添加硒對綿羊精子GLUTs表達(dá)的影響

2.4 綿羊精子GLUTs的定位

免疫熒光檢測結(jié)果如圖3所示，GLUT3與GLUT8兩種蛋白表達(dá)位置不同。GLUT3的陽性區(qū)域主要在精子的頭部、精子中段及尾段；GLUT8蛋白主要定位于精子頂體、頭部以及精子中段。

3 討論

圖3 綿羊精子GLUT3、GLUT8蛋白的定位

硒對動物精液品質(zhì)提高的研究已經(jīng)日趨完善，缺硒動物日糧中添加硒元素能提高動物的精液品質(zhì)。金海峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加硒能提高羔羊的精子活力。王海娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)日糧添加有機(jī)硒，可不同程度地提高小鼠精子的質(zhì)量。然而，不同種類動物中硒的添加量不同，而且由于不同地域硒水平不同，硒的添加效果差異很大。根據(jù)課題組多年的研究，初步確定了山西綿羊和山羊日糧中硒的適宜添加量[13-15]。本試驗(yàn)公羊日糧中亞硒酸鈉的添加量為0.5 mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硒處理組的公羊精子活力有了顯著提高。此外，本試驗(yàn)還通過CASA系統(tǒng)分析了精子的運(yùn)動參數(shù)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，硒處理組的精子的VSL、VCL與VAP都顯著提高，表明硒的添加有效地提高了精子的運(yùn)動能力。硒提高動物精子運(yùn)動能力的原因可能是多方面的。首先，雄性動物的精子發(fā)生主要依賴于睪酮，硒通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成為正常的精子發(fā)生和精子運(yùn)動提供適宜的內(nèi)分泌環(huán)境[16]；其次，硒作為一種抗氧化劑可以提高機(jī)體和精清的抗氧化酶活性[14]，減少了氧自由基對精子線粒體和膜結(jié)構(gòu)的損傷，保障精子尾部結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而維持精子正常的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動能力。而本試驗(yàn)中對照組與硒處理組精子質(zhì)量差異顯著，可能的原因是山西地處我國嚴(yán)重缺硒地區(qū)，飼草料中的硒嚴(yán)重不足，因此在日糧中添加硒可以增強(qiáng)精子品質(zhì)的效果異常顯著。精子質(zhì)量是評價(jià)公畜繁殖性能的重要指標(biāo)，精子活力則是精子質(zhì)量評估中最基本，也是最重要的指標(biāo)之一，它最直觀地反映了精子的受精能力[17]，只有高活力的精子才能經(jīng)由直線運(yùn)動完成受精過程。雖然在公畜日糧中添加硒元素能有效提高精液品質(zhì)，但需要根據(jù)該區(qū)域的硒狀況確定適宜的添硒量。

線粒體是能量代謝中最重要的細(xì)胞器，主要分布于精子的中段和尾段，它的功能是否正常直接決定了精子的活力和運(yùn)動參數(shù)，尤其是精子的直線前進(jìn)的能力。白修云等[18]研究表明，線粒體活性低的精子不具備受精的功能。而硒在精子中主要分布于精子頭部以及中段的線粒體膜中，可以選擇性地結(jié)合于精子尾部中段，缺硒會造成精子中段的膜結(jié)構(gòu)破裂，軸絲外露，從而導(dǎo)致精子線粒體活性異常，造成精子的活力下降[19]；張明等[20]研究表明，低硒可降低大鼠心肌線粒體的活性,使心肌細(xì)胞損傷；高良才等[21]則發(fā)現(xiàn)，硒能拮抗氧自由基引起的線粒體活性異常。在本研究中，日糧中添加0.5 mg/kg的硒不但提高了線粒體的活性，而且保護(hù)了精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性，與上述研究結(jié)果一致。說明硒的添加有效地提高了線粒體的活性，還保護(hù)了精子質(zhì)膜的完整性，使精子保持正常的結(jié)構(gòu)功能，從而提高了精子質(zhì)量，這也是硒處理組精子活力更高的原因。

GLUTs是精子能量代謝相關(guān)蛋白，主要負(fù)責(zé)糖類的攝取，其表達(dá)量高低直接影響精子從環(huán)境中攝取糖類的效率，進(jìn)而影響到精子活力與線粒體活性[22-23]。本研究采用Western Blot與免疫熒光方法分別確定硒處理組與對照組GLUT3、GLUT8的表達(dá)量差異與陽性定位。結(jié)果顯示，GLUT3主要表達(dá)于精子的頭部、精子中段及尾段，且硒處理組的GLUT3蛋白表達(dá)量顯著高于對照組，這可能是由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）會與精子質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成精子質(zhì)膜受損，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)蛋白的重新定位與丟失，造成GLUT3的表達(dá)下降，而硒處理組提高了精子的質(zhì)膜完整性，從而導(dǎo)致其表達(dá)量高于對照組。GLUT8蛋白的陽性區(qū)域主要存在于精子頂體、頭部以及精子中段線粒體密集部位。硒處理組的表達(dá)量顯著高于對照組，推測可能是由于GLUT8主要位于精子頂體和線粒體密集部位，隨著精子代謝產(chǎn)生ROS導(dǎo)致精子線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促使線粒體膜通透性改變，最終導(dǎo)致線粒體腫脹，外膜漲破，從而造成GLUT8蛋白表達(dá)下降，而對照組線粒體活性更低，也印證了這個(gè)觀點(diǎn)，這與Sancho等[24]的研究結(jié)果相似。在本研究中，GLUT3、GLUT8蛋白的表達(dá)量與精子的質(zhì)量成正比，且都廣泛地存在于線粒體密集部位，推測可能是GLUT3、GLUT8蛋白與精子線粒體的能源供應(yīng)密切相關(guān)，GLUT3、GLUT8蛋白的豐度變化可能直接導(dǎo)致精子細(xì)胞能量供應(yīng)不足或營養(yǎng)利用能力下降，這也可能是精子活力和運(yùn)動參數(shù)下降的主要原因。Gawlik等[25]發(fā)現(xiàn)，敲除SLC2A8的小鼠不僅精子活力下降了50%，其線粒體膜電位和精子細(xì)胞中ATP水平也表現(xiàn)出不同程度的降低，這也與本試驗(yàn)結(jié)果一致，印證了上述可能。因此，日糧中添加硒能顯著提高GLUT3、GLUT8蛋白的表達(dá)，從而有助于增強(qiáng)精子細(xì)胞的能量代謝或增加精子細(xì)胞的能量供應(yīng)。同時(shí)，GLUTs可能是維持精子活力的最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，并在精子細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

日糧中添加0.5 mg/kg亞硒酸鈉可顯著提高精子線粒體活性，保護(hù)精子質(zhì)膜完整性，提高Glut3、Glut8蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)精子細(xì)胞的能量代謝，從而提高精子的活力與運(yùn)動參數(shù)，改善精液品質(zhì)。