■趙曉鈺 王俊花 高 雨 李海英楊 敏 馬超宇 張九龍

（新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊830052）

腸道微生物系統(tǒng)作為動物腸道內最復雜的系統(tǒng)，其中的大量微生物參與養(yǎng)分的吸收和代謝，并影響動物生產性能和腸道健康[1]。動物腸道微生物可以產生大量益生菌，且腸道中的有益菌群在提高營養(yǎng)物質利用以及維護動物機體健康等方面起了很大的作用。程志斌等[2]研究表明，在蛋雞日糧中添加1 g/kg非淀粉多糖酶（葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶和纖維素酶）和0.4 g/kg植酸酶，均可顯著提高蛋雞產蛋率，降低料蛋比。譚子超等[3]研究表明，在肉雞小麥-豆粕型飼糧中添加3 g/kg復合酶制劑（木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶和植酸酶），可以顯著提高21日齡和42日齡肉雞腸道內乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量。以上研究說明，在家禽飼糧中添加一定比例的酶制劑，使可溶性非淀粉多糖（NSP），如纖維素、半纖維素、果膠等分解成可利用的糖類[4]，并能有效破壞細胞壁中非水溶性抗營養(yǎng)因子，進而有利于細胞內營養(yǎng)物質的釋放，同時有效緩解水溶性NSP導致的食糜黏度過大，從而提高飼料利用率，提高家禽的生產性能。另外，酶制劑還可以促進家禽腸道內有益菌的增殖，減少有害菌的增殖[5-6]。伊犁鵝是我國唯一由灰雁馴化而來的家鵝品種，是優(yōu)質的地方遺傳資源[7]。因其產蛋性能較低，且就巢性強，遠不能滿足規(guī)?；a及市場的需求[8]。本試驗旨在探究飼糧中添加復合酶制劑對伊犁鵝產蛋性能及腸道菌群的影響，為復合酶制劑在伊犁鵝生產中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用復合酶制劑由深圳綠微康生物科技有限公司提供，主要成分為蛋白酶（3 000 U/g）、木聚糖酶（2 000 U/g）、纖維素酶（1 000 U/g）、甘露聚糖酶（800 U/g）、α-淀粉酶（500 U/g）、普羅蘭酶（300 U/g）。

1.2 試驗動物與試驗設計

試驗采用單因素試驗設計，以健康狀況良好、體重相近、飼養(yǎng)管理水平一致，并處于產蛋期的200只4歲伊犁鵝為試驗對象，由新疆額敏縣恒鑫實業(yè)有限公司國家級伊犁鵝保種場提供。隨機分為4組，每組10個重復，每個重復5只鵝（公母比例1∶4）。各組間正試鵝初始產蛋率均無顯著差異（P＞0.05）。對照組飼喂玉米-豆粕型飼糧，試驗組在對照組的基礎上分別添加0.2、0.3、0.4 g/kg的復合酶制劑。預試期7 d，試驗期為35 d。試驗分組見表1，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗設計與分組

1.3 試驗動物飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在新疆額敏縣恒鑫實業(yè)有限公司國家級伊犁鵝保種場進行，試驗鵝采用單圈常規(guī)飼養(yǎng)方式，種鵝舍內有產蛋窩、食槽、地面運動場和水面運動場。試驗期間，試驗鵝自由采食和飲水，分2次投喂（每天08:00和16:00各喂料1次），投料后撿蛋并記錄。

1.4 產蛋性能測定

每日準確記錄各重復組試驗鵝的飼料消耗量、總蛋重、總產蛋個數(shù)、不合格蛋數(shù)，根據飼養(yǎng)記錄計算第2周（1～14 d）、第4周（1～28 d）及全期（1～35 d）的平均日采食量、平均日產蛋量、平均蛋重、產蛋率、料蛋比和商品蛋合格率。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

平均日采食量[g/(只·d)]=總耗料量（g）/（飼養(yǎng)天數(shù)×總鵝數(shù)）

平均日產蛋量（g/d）=總產蛋量（g）/飼養(yǎng)天數(shù)（d）

平均蛋重（g）=總產蛋量（g）/總產蛋數(shù)

產蛋率（%）=總產蛋數(shù)/（飼養(yǎng)天數(shù)×總鵝數(shù)）×100

料蛋比=總耗料量（kg）/總產蛋重（kg）

商品蛋合格率（%）=合格蛋數(shù)/總產蛋數(shù)×100

1.5 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗結束的當天，從對照組和試驗Ⅱ組（由前期試驗產蛋數(shù)據可得，試驗Ⅱ組為產蛋性能最佳組）中各隨機選取8只體重接近的伊犁鵝，屠宰后迅速采集盲腸內容物，置于液氮中保存。對照組盲腸內容物樣品分別命名為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7及A8，試驗Ⅱ組盲腸內容物樣品分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7及B8。

1.6 DNA提取與高通量測序

使用CTAB法對伊犁鵝盲腸內容物的DNA進行提取。使用細菌16S rRNA通用序列擴增16S rRNA V3～V4可變區(qū)。引物序列為341F：CCTAYGGGRBG?CASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。擴增程序：98℃預變性1 min；30個循環(huán)包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。純化PCR產物，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后使用NovaSeq6000進行上機測序。測序得到的原始數(shù)據經過質量過濾，對通過質量過濾的序列進行連接，得到每個樣品的有效序列。對有效序列進行進一步過濾和去除嵌合體處理，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質序列。16SrRNA V3～V4可變區(qū)擴增和測序工作由諾禾致源生物技術有限公司完成。

1.7 數(shù)據統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010軟件、SPSS 20.0軟件進行產蛋數(shù)據的統(tǒng)計與分析。采用Uparse7.0.1001軟件、R2.15.3軟件及Qiime 1.9.1軟件等進行盲腸內容物菌群數(shù)據的統(tǒng)計及分析。

2 結果與分析

2.1 復合酶制劑對伊犁鵝產蛋性能的影響

表3 復合酶制劑對伊犁鵝產蛋性能的影響

由表3可知，在試驗的第2周，試驗各組之間在產蛋性能方面均差異不顯著（P＞0.05）。在試驗的第4周，與對照組相比，試驗Ⅱ組產蛋率極顯著提高81.37%（P＜0.01），與試驗Ⅰ、Ⅲ組相比，試驗Ⅱ組產蛋率分別顯著提高33.80%（P＜0.05）、30.01%（P＜0.05）；與對照組相比，試驗Ⅱ組料蛋比顯著降低41.31%（P＜0.05）。綜合全期，與對照組和試驗Ⅰ組相比，試驗Ⅱ組產蛋率分別顯著提高33.33%（P＜0.05）和31.82%（P＜0.05）；與對照組相比，試驗Ⅱ組料蛋比顯著降低23.67%（P＜0.05）。其余各組各指標間均差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 復合酶制劑對伊犁鵝盲腸微生物菌群的影響2.2.1 數(shù)據預處理及質控

通過對reads剪切過濾，每個樣品平均測得9.23×104條raw reads，并通過質量控制每個樣品平均獲得8.58×104條clean reads，序列的平均長度在418 bp，Q20均在97.83%以上，說明所得數(shù)據質量較好，能保證后續(xù)試驗分析的可靠性。

2.2.2 盲腸微生物的OTUs注釋結果(見圖1)

圖1 韋恩圖

由圖1韋恩圖可知，對照組共獲得2 133個操作分類單元（OTUs），復合酶制劑組共獲得2 111個OTUs，分別占總OTUs個數(shù)的90.77%和89.83%。其中，對照組特有239個OTUs，復合酶制劑組特有217個OTUs，共有的操作分類單元(OTUs)有1 894個，占總OTUs個數(shù)的80.60%，說明兩組伊犁鵝盲腸結構具有很高的相似性。

2.2.3 稀釋曲線

由圖2可知，在測序量達到49 000時，細菌稀釋曲線接近平臺期，即使有再多的數(shù)據量也只能產生很少的OTUs，表明當前的測序量能夠很好地反映出樣品中細菌群落結構和多樣性。

2.2.4 腸道菌群Alpha多樣性分析

將對照組和0.3 g/kg酶制劑組(試驗Ⅱ組)樣品所有序列按97%的相似度進行OTUs聚類，利用程序運算得到評價樣品中群落豐富度和多樣性的Alpha多樣性指數(shù)(見表4)，Alpha多樣性指數(shù)包括Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods coverage指數(shù)。由表4可知，對照組和0.3 g/kg酶制劑組間Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods coverage指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 稀釋曲線

表4 盲腸微生物多樣性指數(shù)分析

2.2.5 微生物豐富度和多樣性的分析

2.2.5.1 復合酶制劑對盲腸內容物門水平菌群豐度的影響(見表5、圖3)

表5 復合酶制劑對盲腸內容物門水平菌群豐度的影響(門水平%)

由表5和圖3可知，在微生物分類門水平上，通過NovaSeq測序，檢測到的前10個菌門中，對照組有6個優(yōu)勢菌群（豐度＞1%為優(yōu)勢菌群），分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Pro?teobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verru?comicrobia）和放線菌門（Actinobacteria），其占比分別為45.20%、32.26%、11.17%、3.61%、1.11%和3.64%。復合酶制劑組有4個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌門（Bac?teroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteo?bacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其占比分別為54.76%、29.87%、10.14%和2.61%。以上結果表明，盲腸菌群中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為主要菌門，復合酶制劑組擬桿菌門相對豐度極顯著升高（P＜0.01），而梭桿菌門相對豐度極顯著降低（P＜0.01）。

圖3 對照組和0.3 g/kg酶制劑組在門水平上的相對豐度

2.2.5.2 復合酶制劑對盲腸內容物屬水平菌群豐度的影響(見表6、圖4)

表6 復合酶制劑對盲腸內容物屬水平菌群豐度的影響(屬水平%)

圖4 對照組和0.3 g/kg酶制劑組在屬水平上的相對豐度

由表6和圖4可知，在微生物分類屬水平上，檢測到的前10個屬中，對照組有9個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌屬（Bacteroides）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、Peptoclostridium、unidentified_Ru?minococcaceae、Subdoligranulum、消化球菌屬（Peptococ?cus）、Fournierella和Akkermansia。其 占 比 分 別 為22.10%、3.63%、3.61%、3.40%、3.14%、2.46%、1.65%、1.41%和1.09%。復合酶制劑組有6個優(yōu)勢菌群，分別是擬桿菌屬（Bacteroidetes）、脫硫弧菌屬（Desulfovi?brio）、unidentified_Ruminococcaceae、Fournierella、Sub?doligranulum和巨單胞菌屬（Megamonas），其占比分別為32.00%、5.95%、3.50%、1.95%、1.82%和1.72%。以上結果表明，盲腸菌群中擬桿菌屬為主要菌屬，復合酶制劑組擬桿菌屬相對豐度極顯著升高（P＜0.01），而梭桿菌屬相對豐度極顯著降低（P＜0.01），脫硫弧菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復合酶制劑對伊犁鵝產蛋性能的影響

飼料酶制劑主要是降解類的酶制劑，把抗營養(yǎng)物質[非淀粉多糖(NSP)和植酸鹽]或營養(yǎng)物質（蛋白質和淀粉）降解為無抗營養(yǎng)特性的成分或容易吸收的營養(yǎng)成分[9]。玉米和豆粕中含有大量的NSP，添加酶制劑可去除飼料中的NSP，釋放更多的營養(yǎng)物質，從而提高動物的生產性能。孫旺斌等[10]研究表明，在海蘭褐蛋雞日糧中添加0.4%的復合酶制劑（α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等）可顯著提高蛋雞的產蛋率，降低料蛋比。宋連喜等[11]在蛋雞日糧中添加0.1%的復合酶制劑（酸性蛋白酶、木聚糖酶、果膠酶等）可以使產蛋率顯著提高，料蛋比顯著降低。本試驗結果表明，添加0.3 g/kg復合酶制劑可顯著提高產蛋期伊犁鵝的產蛋率（P＜0.05），顯著降低料蛋比，與上述孫旺斌[10]、宋連喜等[11]研究結果基本一致?？赡艿脑蚴窃诋a蛋期伊犁鵝飼糧中添加復合酶制劑，可去除玉米-豆粕型飼糧中的NSP，釋放更多的營養(yǎng)物質，維持腸道健康，從而提高動物的產蛋性能[12]。

3.2 復合酶制劑對伊犁鵝盲腸微生物菌群的影響

3.2.1 復合酶制劑對盲腸微生物菌群Alpha多樣性的影響

腸道菌群多樣性是促進營養(yǎng)物質吸收、維持機體免疫等生命活動的基礎，多樣性的增加有利于機體新陳代謝和免疫防御，進而有益于宿主健康[13]。Alpha多樣性分析反映微生物群落的多樣性和豐度[14]，Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)用于評估菌群的豐度[15]。Shannon多樣性指數(shù)越大，說明群落多樣性越高[16]。Simpson指數(shù)越小說明樣品中物種越豐富[17]，Goods coverage指數(shù)表示各樣品文庫的覆蓋率，實際反映了本次測序結果是否代表樣本的真實情況[18]，Goods coverage指數(shù)均大于0.99，說明了該測序結果已基本覆蓋樣本的多樣性[19]。本試驗結果顯示，對照組和0.3 g/kg酶制劑組間豐度指數(shù)、香農指數(shù)、辛普森指數(shù)和覆蓋度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），說明添加復合酶制劑未改變伊犁鵝盲腸內容物的多樣性。

3.2.2 復合酶制劑對盲腸微生物菌群門水平的影響

盲腸在家禽糖類代謝和氮代謝的過程中起重要的作用，盲腸內的擬桿菌在幫助分解多糖、提高多糖利用率[20]、加快黏膜發(fā)育[21]及維持腸道微生態(tài)平衡[22]方面起到了積極的作用，較高豐度的擬桿菌有利于腸道中營養(yǎng)物質吸收[23]。梭桿菌包含壞死梭桿菌和核梭桿菌等多種致病菌，對動物具有毒害作用[17]。本試驗通過盲腸微生物門水平的組成分析發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是盲腸微生物的主要組成部分，這與鵝[24]和雞[19]盲腸中的微生物組成的報道相一致。Yan等[25]在揚州鵝飼糧中添加不同比例的發(fā)酵飼料，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門豐度顯著增加，可能與鵝的生產性能呈正相關。陳繼發(fā)等[17]研究表明，在蛋雞飼糧中添加0.9 g/kg蒙脫石可顯著提高產蛋雞日產蛋量（P＜0.05），同時盲腸中梭桿菌門的相對豐度也有一定程度降低。本試驗在產蛋期伊犁鵝的日糧中添加復合酶制劑，極顯著增加了伊犁鵝盲腸門水平上擬桿菌門的相對豐度（P＜0.01），極顯著降低了梭桿菌門的相對豐度（P＜0.01）。飼糧中復合酶制劑的添加改善了產蛋期伊犁鵝的盲腸菌群結構，增加了有益菌的豐度，降低了有害菌的豐度，提高了營養(yǎng)物質的利用率，維持腸道健康。

3.2.3 復合酶制劑對盲腸微生物菌群屬水平的影響

鵝消化纖維素的主要場所在盲腸，盲腸中含有大量降解纖維素的微生物，將纖維素分解為可被吸收的營養(yǎng)物質。研究發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌屬具有很高的纖維降解能力[26]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)添加0.3 g/kg復合酶制劑顯著增加了脫硫弧菌屬的豐度（P＜0.05），提示添加復合酶制劑可提高伊犁鵝盲腸纖維素的降解能力。龍建華等[27]研究表明，擬桿菌屬豐度的顯著增加，提高了五龍鵝對糖類物質的分解和利用，進而提高五龍鵝的生長性能。蒲翠敏[28]在正常櫻桃谷鴨與患鴨瘟病的櫻桃谷鴨腸道微生物比較研究中，發(fā)現(xiàn)患病組較正常組梭桿菌屬豐度顯著增加（P＜0.05）。本試驗添加0.3 g/kg復合酶制劑，試驗鵝盲腸擬桿菌屬的相對豐度得到了極顯著增加（P＜0.01），而梭桿菌屬的相對豐度極顯著降低（P＜0.01），這與本試驗盲腸微生物菌群在門水平上的結果相一致，表明添加復合酶制劑增加了產蛋期伊犁鵝盲腸內的有益菌的數(shù)量，降低了盲腸內有害菌的數(shù)量，有利于維持機體腸道的健康和營養(yǎng)物質的消化利用，這與本試驗中伊犁鵝產蛋率的提高相印證。

4 結論

本試驗條件下，在飼糧中添加0.3 g/kg復合酶制劑可顯著提高伊犁鵝產蛋率，顯著降低料蛋比，顯著或極顯著增加盲腸有益菌（擬桿菌門、擬桿菌屬、脫硫弧菌屬）的相對豐度，極顯著減少有害菌（梭桿菌門、梭桿菌屬）的相對豐度，有助于提高伊犁鵝腸道的消化吸收功能和預防腸道疾病，從而提高伊犁鵝的產蛋性能。