■縱 瑞 胡忠澤* 張乃鋒 段心明

(1.安徽科技學院動物科學學院，動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室，安徽滁州233100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；3.農(nóng)發(fā)苑（浙江）農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江湖州313000)

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）因其獨特的抗細菌、真菌、病毒以及抗癌細胞等生物學功能且不易產(chǎn)生耐藥性，使其成為最有前景的抗生素替代品之一。從20世紀80年代瑞典科學家Hulmark從惜古比天蠶（Hyalophora cecropia）中分離出第一種抗菌肽，命名為天蠶素（Cecropin）[1]，到目前為止抗菌肽數(shù)據(jù)庫中已注冊的抗菌肽序列已經(jīng)超過3 000個[2]?？咕氖前ㄖ参铩游锖腿祟愒趦?nèi)的所有生物體天然免疫反應的保守部分,是許多脊椎動物免疫系統(tǒng)的主要組成部分[3]，被定義為能夠保護宿主免受細菌、病毒或真菌入侵的關鍵防御分子[4]。抗菌肽是由基因編碼、核糖體合成的多肽，通常具有短肽（30～60個氨基酸）、強陽離子（pI 8.9～10.7）、熱穩(wěn)定性（100℃,15 min）、不易產(chǎn)生耐藥性、對真核細胞無影響等共同特征[5]。根據(jù)其來源可以分為：植物源抗菌肽，如硫素（thionins）、植物防御素(plant defensins)；動物源抗菌肽，如天蠶素、防御素；微生物源抗菌肽，如細菌素和病毒源抗菌肽；人工來源抗菌肽[6]。根據(jù)作用對象的不同可以將其分為：抗細菌類抗菌肽，如防御素（defensin）-NV、天蠶素抗菌肽（ce?cropin antibacterial peptide,CAP）-A；抗真菌類抗菌肽，如蜾蠃毒肽（Orancistrocerus drewseni venom pep?tides,OdVP）2及其類似物OdVP2L[5]；抗病毒類抗菌肽，如從金錢魚肝臟克隆的SA-肝肽（Scatophagus ar?gus hepcidin,SA-Hepcidin）[7]；抗癌細胞類抗菌肽，如人β防御素（humanβ-defensin,HBD）-3[8]；抗寄生蟲類抗菌肽，如蛙皮素和Cecropin[9]；根據(jù)抗菌肽的二級結構以及氨基酸組成可以分為α螺旋、β鏈、環(huán)狀結構和延伸結構以及富含脯氨酸以及甘氨酸的抗菌肽[10]。本文將從抗菌肽發(fā)展現(xiàn)狀、生物學功能、作用機制、在反芻動物中的應用、存在問題與發(fā)展前景等方面進行綜述。

1 抗菌肽抗菌功能與機制

與作用于細胞內(nèi)特定通路或受體的抗生素不同，大多數(shù)抗菌肽以細菌細胞膜為靶標，不需要特定的受體，因此不易引起細菌突變，可以抵抗細菌耐藥性的產(chǎn)生[11]。抗菌肽對細菌的作用機制分為細胞膜損傷機制和細胞內(nèi)作用機制。抗菌肽抑菌方式與細菌細胞膜的結構和性質(zhì)以及抗菌肽所含的氨基酸組成有著密不可分的關系。

1.1 細胞膜損傷機制

帶正電荷的抗菌肽通過靜電作用與帶負電荷的細菌細胞壁相接觸，并優(yōu)先與細菌細胞質(zhì)膜中的負電荷磷脂基團如磷脂酰甘油和心磷脂相互作用，取代穩(wěn)定這些磷脂基團的二價陽離子，造成膜擾動?？咕睦闷潆p親性特性插入磷脂雙分子層內(nèi)，導致膜結構的改變，如膜變薄、膜曲率改變以及雙分子層屏障的破壞[12]。研究表明抗菌肽的作用方式具體取決于它們的結構屬性，如氨基酸序列、分子量大小、陽離子性質(zhì)、疏水性和兩親性[13]。根據(jù)作用方式的不同，目前提出的4種模型：如聚集體模型（aggregate model）、環(huán)形孔模型（toroidal-pore model）、桶-板模型（barrelstave model）、毯式模型（carpet model），具體模型機制Jenssen等[14]研究已經(jīng)做了詳細的綜述。見圖1。

圖1 AMPs細胞膜作用機制模型

1.2 細胞內(nèi)作用機制

與大多數(shù)與細胞膜相互作用的抗菌肽不同，富含脯氨酸的抗菌肽（proline-rich AMPs,PrAMPs），如on?cocins-112（Onc112)和牛抗菌肽（bactenecins-7,Bac7)可以通過細菌細胞膜上的一個或多個轉(zhuǎn)運體利用橫跨內(nèi)膜的質(zhì)子電化學梯度轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，在不溶解細胞膜的前提下通過大量的氫鍵堆積與細胞70s核糖體相互作用，影響生物蛋白的合成[15]；陽離子抗菌肽Mel4則通過激活細菌內(nèi)部自溶酶從而誘導細菌死亡[16]；這就解釋了抗菌肽濃度在較低的情況下仍有殺菌能力。

2 抗菌肽調(diào)節(jié)炎癥與免疫功能的機制

炎癥反應是機體天然免疫細胞（如樹突狀細胞以及巨噬細胞等）識別外源性物質(zhì)或壞死組織等致炎因子并激發(fā)的防御性反應，然而炎癥反應過度會造成機體自身損傷[17]?？咕目梢杂行б种粕镏卵滓蜃樱ㄈ缂毦?、真菌、病毒等病原體）從而發(fā)揮抗炎作用，減輕炎癥對機體的傷害。如魚源抗菌肽（chionodracine,Cnd）衍生肽Cnd-m3a對多重耐藥細菌有很好的抑制作用[18]；根據(jù)蛙源抗菌肽Ranacyclin AJ設計出的抗菌肽AKK8對白色念珠菌展現(xiàn)出較強的抗菌活性，且有效抑制了白色念珠菌感染引起的小鼠全身性炎癥反應[19]；人角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的抗菌肽LL-37、HBD等可以通過破壞病毒包膜以及抑制病毒與細胞表面受體結合等方式阻止病毒進入細胞或者干擾病毒在細胞內(nèi)復制來抵抗病毒感染[20]；宿主防御肽（host defense peptides,HDPs）在體外表現(xiàn)出脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）結合活性，從而抑制THP-1細胞中核轉(zhuǎn)錄因子-B（nu?clear factor-kappa B,NF-κB）炎癥信號通路的活化，減少LPS介導的促炎因子的產(chǎn)生[21]；而豬乳鐵蛋白肽（lactoferrin peptide,LFP）-20可直接影響炎癥通路中重要的銜接蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentia?tion factor 88,MyD88）的表達，阻斷了其與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）和NF-κB依賴的信號分子間相互作用，調(diào)控LPS介導的活化巨噬細胞的炎癥反應，發(fā)揮抗炎作用[22]。

趨化作用是指趨化因子控制免疫細胞定向遷移至炎癥部位，是機體免疫應答發(fā)生和完成的必要條件?？咕目梢灾苯踊蜷g接誘導趨化作用，如抗菌肽KSL-W對中性粒細胞顯示出微摩爾量的趨化性，并且能夠誘導中性粒細胞中的肌動蛋白聚合[23]；而先天防御調(diào)節(jié)肽（innate defense regulator,IDR）和HDPs通過誘導趨化因子的產(chǎn)生進而對中性粒細胞和單核細胞起到間接趨化作用[24]。淋巴細胞增殖是衡量機體免疫能力的一個重要指標，在仔豬日糧中添加抗菌肽加強T淋巴細胞的增殖功能，降低凋亡細胞的百分率，明顯改善斷奶仔豬細胞免疫[25]。天蠶桿菌肽顯著提高了肉雞新城疫抗體水平和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，有效增強機體免疫力[26]?？咕倪€可提高血清補體C4（complement-4,C4）的含量以增強免疫功能[27]。

3 抗菌肽對機體屏障的作用與機制

大量研究證實抗菌肽對屏障組織具有很好的調(diào)控作用。Otvos等[28]研究發(fā)現(xiàn)LFP能夠調(diào)節(jié)炎癥反應、改善角質(zhì)形成細胞功能、促進傷口再上皮化以及成纖維細胞的增殖和遷移，人源抗菌肽LL-37同樣具有類似的作用。腸道屏障功能主要由調(diào)節(jié)黏蛋白和緊密連接蛋白共同維持[29]，緊密連接蛋白是腸道物理性屏障的基礎。外源添加抗菌肽LL-37重建了鼠傷寒沙門氏菌破壞的結腸T84細胞緊密連接中閉合小環(huán)蛋白-1（zonula occludens proteins-1,ZO-1）的網(wǎng)狀模式[30]。而有些抗菌肽卻加大了緊密連接和細胞質(zhì)膜的通透性，研究人員通過分子模擬確定了緊密連接蛋白claudins為抗菌肽PN159潛在作用靶點，發(fā)現(xiàn)PN159通過與claudin-4和claudin-7保守氨基酸殘基相互作用打開了細胞旁通路，安全且可逆地增強了Caco-2腸屏障模型的通透性，并發(fā)現(xiàn)其還具有增強細胞膜通透性以及抗菌功能[31]。

4 抗菌肽在反芻動物中的應用進展

反芻動物的瘤胃里面生活著大量微生物，抗菌肽可通過作用于細菌、原蟲、古菌以及真菌等微生物，從而對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生重要影響?？咕耐ㄟ^與古菌細胞壁相互作用或與其細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)相結合的方式對古菌產(chǎn)生抑制作用，減少甲烷氣體的產(chǎn)生[32]。牛鏈球菌細菌素Bovicin HC5可以抑制瘤胃古菌，減少近50%甲烷的產(chǎn)生[33]。乳酸鏈球菌素(Nisin)在抑制甲烷產(chǎn)生、調(diào)節(jié)瘤胃微生物菌群，降低瘤胃乙丙酸比值方面較莫能菌素具有更大的優(yōu)勢[34]。Liu等[35]在山羊精料中添加抗菌肽影響了瘤胃中微生物多樣性及纖毛蟲的群落結構，并對幼山羊的生長性能、瘤胃發(fā)酵功能、酶活性和瘤胃形態(tài)均有一定的促進作用。Ren等[36]研究發(fā)現(xiàn)，添加抗菌肽調(diào)節(jié)了山羊瘤胃微生物結構，從而影響了瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid,TVFA）的濃度及消化酶的組成，提高了飼料利用率，改善了山羊的生長性能。陳亞迎[37]在湖羊日糧中添加Nisin和溶菌酶降低了瘤胃中高效產(chǎn)氨菌（hyper ammonia-producing bacteria,HAB），減少了氨氮的生成，增加了氮沉積，并降低了古菌的相對豐度，提高了能量利用率，促進了湖羊的生長。李世易[38]通過在湖羊日糧中添加蜂蜜肽增加了湖羊的日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，抑制了瘤胃革蘭氏陰性菌，調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵，提高了育肥湖羊的生產(chǎn)性能。

研究表明，抗菌肽可以通過間接機制為機體提供保護，它們不僅僅可以殺死微生物，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，改變宿主基因的表達，或者作為趨化因子以及誘導趨化因子的產(chǎn)生抑制促炎細胞因子的分泌，并調(diào)節(jié)T淋巴細胞對適應性免疫反應的反應[39]。楊顏銥[40]在山羊日糧中添加高精料和抗菌肽促進了血清中免疫球蛋白，促炎因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-12的分泌，提高了血清中補體的含量以及淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率和紅細胞免疫，增強了山羊的體液免疫和細胞免疫。陳憧[41]研究表明，山羊日糧中添加復合抗菌肽增強了山羊的紅細胞免疫，提高了血清中免疫球蛋白含量，并對山羊的抗氧化能力也有顯著提升。秦龍[42]研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊日糧中添加抗菌肽提高了血清中免疫球蛋白含量，并降低了羔羊肝臟組織中炎癥基因IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor ne?crosis factor,TNF）-α和干擾素（interferon,IFN）-γ的表達，有助于羔羊免疫系統(tǒng)的建立。

抗菌肽對動物腸道屏障的影響主要集中于仔豬[43]和家禽[44]方面，而關于抗菌肽對反芻動物腸道屏障的研究很少見報道。由于食管溝反射，反芻動物哺乳期采食乳汁直接由食管進入瓣胃，主要在皺胃和小腸內(nèi)消化吸收[45]，因此在羔羊日糧中添加抗菌肽效果與哺乳仔豬類似。秦龍[42]在羔羊日糧中添加人工合成抗菌肽CC31改善了腸道組織形態(tài)結構，腸道上皮緊密連接蛋白基因表達量也相對上調(diào)，另外提高了腸道菌群的豐富性和多樣性，促進了有益菌群的定植，抑制了有害菌的增殖，增強了腸道屏障，有利于羔羊的健康。

國內(nèi)外對抗菌肽替代抗生素治療乳房炎等疾病方面也進行了大量的研究，Maina等[46]報道枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素有較好的穩(wěn)定性，對奶牛乳房炎病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。丁酸鈉可以通過組蛋白去乙?；?、NF-κB途徑等影響牛乳腺上皮細胞內(nèi)源性抗菌肽的基因表達，進而在金黃色葡萄球菌感染和脂磷壁酸（lipotei?choic acid,LTA）刺激的牛乳腺上皮細胞中發(fā)揮抑菌抗炎作用[47]。研究發(fā)現(xiàn)真菌防御素plectasin的衍生肽NZ2114針對乳房炎病原菌無乳鏈球菌相比于抗生素有更好的殺菌活性，且對無乳鏈球菌生成的生物膜有很好的抑制作用；另外通過金黃色葡萄球菌體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)其可以作用于細胞膜以及胞內(nèi)脫氧核糖核酸（deoxyribo-nucleic acid,DNA），降低細菌的耐藥性并消除耐藥基因[48-49]?？咕倪€可以提高隱形乳房炎奶牛的產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)、降低牛奶中體細胞數(shù)，提高隱形乳房炎治愈率[50]。有研究證實牛抗菌肽NK-lysin衍生肽對睡眠嗜血桿菌以及牛支原體等多種牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex,BRDC）致病菌表現(xiàn)出抗菌活性[51-52]。

5 抗菌肽應用的影響因素

5.1 安全性問題

有研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射抗菌肽會對腎臟和神經(jīng)產(chǎn)生毒副作用，另外有些抗菌肽在殺菌的同時具有溶血性。研究人員發(fā)現(xiàn)取代彼得異蝎肽Hp1404 N端的第一個氨基酸殘基設計的衍生肽K1K8，極大地降低了其溶血性[53]。真核細胞表面不帶電荷，因此抗菌肽只能依靠兩親性與細胞相結合，研究發(fā)現(xiàn)可以通過破壞抗菌肽的兩親性從而減少抗菌肽與真核細胞間發(fā)揮作用，以此減少細胞毒性[54]。

5.2 穩(wěn)定性問題

天然抗菌肽穩(wěn)定性的問題制約著其在實際生產(chǎn)中的應用。研究人員通過將黃蜂Polybiapadista毒液中提取的抗菌肽Polybia-MPI中所有的L-氨基酸用非天然D-氨基酸替換，由于空間構型上的差異，使蛋白酶無法水解D-氨基酸構成的肽鍵[55]，或者通過構建抗菌肽遞送載體的方式[56]提高了抗菌肽的蛋白酶穩(wěn)定性。羅文杰等[57]通過截取天然抗菌肽N端氨基酸殘基，并進行固相合成，證明其在100℃以及在不同鹽濃度以及酸堿度（pH）條件下均可保持抗菌活性。

5.3 來源問題

抗菌肽最初來源于生物體內(nèi)的天然抗菌肽，但是產(chǎn)量較低且分離困難；化學合成方法成本較高，且難以保持其空間結構從而影響其生物學活性；基因工程重組蛋白表達因其產(chǎn)量較高成為目前較為主流的生產(chǎn)抗菌肽的方法，因其后期產(chǎn)物難以獲得純品而受到限制，但是可以通過優(yōu)化反應條件，并采用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱等技術對重組蛋白進行純化，進而獲得高效產(chǎn)出并且純度高的抗菌肽[58]。

5.4 抗菌活性問題

抗菌肽對比抗生素在抗菌活力和抗菌譜方面還是存在差距。有研究表明，抗菌肽的抗菌效價與其所帶電荷數(shù)有關，如Gong等[59]用帶正電荷的賴氨酸取代了皮抑菌肽Dermaseptin-AC親水性表面的不帶電荷的丙氨酸，降低了其最小抑菌濃度。但當正電荷增加到一定值后導致抗菌肽之間的靜電斥力大于抗菌肽與細胞膜表面的吸引力，從而抑制抗菌肽與細胞膜的結合，導致抗菌能力下降[60]。此外螺旋結構可以促進抗菌肽插入細菌細胞膜，研究人員發(fā)現(xiàn)CAP-A的N端兩親性α-螺旋片段與LL-37的核心抗菌片段相結合設計出具有更多正電荷和更高螺旋結構含量的雜交肽，從而提高了抗菌肽的抗菌活力并降低了溶血性[61]。

5.5 耐藥性的問題

細菌會修飾其細胞壁成分，以減少其表面的凈負電荷。細菌細胞壁的莢膜多糖也可以起到屏蔽作用，阻礙微生物表面與抗菌肽的相互作用。有些細菌可以通過下調(diào)機體抗菌肽基因表達，促進細菌的黏附和侵襲。還有些細菌分泌降解抗菌肽的肽酶和蛋白酶，從而抑制抗菌肽的抗菌活性，線性肽是這些酶的主要靶標[62]。生物被膜也是細菌產(chǎn)生抗藥性的主要原因。抗菌肽的電荷、疏水性和構象等理化性質(zhì)在抗菌活性和生物體選擇性方面起著重要作用。

6 前景展望

抗菌肽因其獨特的抑菌機制，使得細菌不易對其產(chǎn)生耐藥性，并且對抗生素耐藥型菌也展現(xiàn)出良好的抑菌效果，有希望成為抗生素理想替代品?？咕钠琳闲迯秃兔庖哒{(diào)節(jié)功能使其具有良好的促生長和抗病能力。作為一種多肽產(chǎn)物，抗菌肽容易被機體代謝，不易在動物產(chǎn)品中殘留等一系列優(yōu)勢將在推動畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮重要作用。基因工程技術結合適當?shù)谋磉_體系、完善的表達策略和分離純化技術，使得抗菌肽高效低成本的生產(chǎn)成為可能。氨基酸替換、環(huán)化、包埋，抗菌肽修飾等技術提高了抗菌肽的安全性以及穩(wěn)定性。隨著對抗菌肽作用機制和構效關系研究不斷深入以及細菌耐藥性發(fā)生機制的了解，有針對性地對抗菌肽結構進行改造，將極大提高抗菌肽的抗菌活性。在無抗養(yǎng)殖的大趨勢下，國內(nèi)外已有相關企業(yè)對抗菌肽產(chǎn)品進行推廣和研究，應用效果也得到證實，但抗菌肽產(chǎn)品的發(fā)展成熟仍需科研人員與生產(chǎn)企業(yè)進一步合作探索，以便在未來替代抗生素的使用中發(fā)揮巨大作用。