張學(xué)花，邢會(huì)香，劉 紅，曹得輝，毛喜孝，郭 靜

(青海普蘭特藥業(yè)有限公司，青海 西寧 810000)

澤瀉為常用中藥材之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品[1],為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juzep.或澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖[2]。研究表明，澤瀉具有利尿，降血糖、血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗腎結(jié)石形成，抗腎炎活性，免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。澤瀉含有三萜類化合物、倍半萜類化合物、二萜類化合物、類脂、糖類等成分，其中三萜類是澤瀉萜類化合物的主要化學(xué)成分，包括澤瀉醇A、澤瀉醇B及其衍生物[4],澤瀉醇B是利尿成分[5],23-乙酰澤瀉醇B可用于研制新型抗腫瘤藥物[6]。中國(guó)藥典2015版僅測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B的含量[7]，2020版藥典測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C的含量[2]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)澤瀉植株無論哪個(gè)部位澤瀉醇B與23-乙酰澤瀉醇B含量均最高，23-乙酰澤瀉醇C含量最少[8]，因此控制澤瀉藥材中含量較高的澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)于控制藥材質(zhì)量顯得尤為重要。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-CLASS 超高液相色譜儀(ACQUITY UPLC PDA eLambda檢測(cè)器，Waters)，MS105型十萬分之一電子分析天平(METTLER TOLEDO)，ML-204T-02型萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司],JP-080ST型超聲清洗儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司有限公司)。

1.2 藥材與試劑

澤瀉醇B對(duì)照品(NATURE，批號(hào)：18649-93-9，純度：95.0%),23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111846-201705，純度：99.7%)；澤瀉藥材共20批次，產(chǎn)地分別為江西省撫州市、四川省眉山市、廣西省貴港市；甲醇、乙腈均為進(jìn)口色譜純，磷酸為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸；梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?-1.0min(60∶40)、1.0-2.0min(48∶52)、2.0-7.0min(48∶52)、7.0-8.0min(57∶43)、8.0-12.0min(57∶43)、12.0-13.0min(80∶20)、13.0-16.0min(80∶20)、16.0-17.0min(60∶40)；流速為0.50mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm；進(jìn)樣量為5μL。理論板數(shù)按澤瀉醇B峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 70%甲醇水溶液。

2.2.2對(duì)照品溶液 取澤瀉醇B對(duì)照品、23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇水溶液分別制成每1ml含澤瀉醇B 0.1mg、23-乙酰澤瀉醇B50μg的溶液。

2.2.3供試品溶液 取本品粉末(過三號(hào)篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液50mL，稱定重量，超聲處理10min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照2.2方法分別制備得到對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5針，澤瀉醇B峰面積的RSD為0.24%，保留時(shí)間的RSD為0.46%，對(duì)照品和供試品溶液中澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇色譜峰與前后雜質(zhì)峰分離度均大于1.50，澤瀉醇B色譜峰的理論塔板數(shù)均不小于3500，提示該色譜系統(tǒng)系統(tǒng)適用性良好。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按照2.2方法分別制備得到空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，見圖1。結(jié)果顯示空白溶液對(duì)主色譜峰無干擾，對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰保留時(shí)間一致。另采用PDA檢測(cè)器對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液中的主色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和純度檢測(cè)。結(jié)果顯示對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰純度角度均小于純度閾值，純度符合要求，無陰性干擾。具體數(shù)據(jù)見表1。本試驗(yàn)提示該方法專屬性良好。

圖1 澤瀉及其對(duì)照品高效液相色譜圖

表1 澤瀉和對(duì)照品主色譜峰純度角度和純度閾值列表

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1澤瀉醇B對(duì)照品線性關(guān)系考察 精密稱定澤瀉醇B對(duì)照品20.16mg，加70%甲醇水溶液制成192μg/ml的澤瀉醇B對(duì)照品母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成濃度為0.96、48、96、144、192μg/ml的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X,μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=10477X+923.58(r=0.9999)。結(jié)果表明，澤瀉醇B對(duì)照品在0.96-192μg/ml線性關(guān)系良好。

2.5.223-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品線性關(guān)系考察 精密稱定23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品20.33mg，加70%甲醇水溶液制成0.203μg/ml的23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成濃度為10.150、25.375、50.750、76.125、101.500μg/ml的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X,μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=9290.7X+2520.7(r=1.0000)。結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品在10.150-101.500μg/ml線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

由實(shí)驗(yàn)員(甲)分別取澤瀉藥材粉末(過三號(hào)篩)約1g，平行6份樣品，精密稱定，按照2.2.3方法制備得到6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量的RSD分別為2.2%、2.1%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

由另外一名實(shí)驗(yàn)員(乙)分別取澤瀉藥材粉末(過三號(hào)篩)約1g，平行6份樣品，精密稱定，按照2.2.3方法制備得到6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件用另一臺(tái)G18QSM448A超高液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果甲乙兩名實(shí)驗(yàn)員在不同儀器上測(cè)得澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量的RSD分別為3.4%、3.7%，提示該方法中間精密度良好，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的澤瀉藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.5g，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平(50%、100%和150%)的澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品。按照2.2.3項(xiàng)下溶液制備方法制備得到9份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液適量，分別置于室溫下放置0、2、4、8、12、16、24h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果供試品中澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B色譜峰峰面積的RSD值分別為0.8%和0.8%。結(jié)果表明供試品在70%甲醇水溶液中24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 耐用性試驗(yàn)

本研究中耐用性試驗(yàn)是通過微調(diào)測(cè)試條件中的單個(gè)變量觀察結(jié)果的不受影響程度，改變的測(cè)試變量包括流動(dòng)相組成、流速、柱溫、色譜柱。結(jié)果表明該方法耐用性良好，具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品含量測(cè)定

取20批次澤瀉樣品適量，按照2.2.3方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，雙樣雙針，記錄色譜并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表6。

表6 澤瀉樣品中澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

續(xù)表6

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究考察了柱溫、流速、進(jìn)樣體積對(duì)色譜峰分離的效果，結(jié)果當(dāng)柱溫30℃、流速0.35ml/min、進(jìn)樣體積10μl時(shí)峰形均未達(dá)到要求，柱溫40℃、流速0.50ml/min、進(jìn)樣體積5μl時(shí)峰形符合要求。

3.2 提取條件的選擇

本研究考察了不同比例和不同類別的提取溶劑(30%、50%、70%甲醇水溶液，50%乙腈水溶液和50%乙醇水溶液)進(jìn)行提取，同時(shí)考察了不同提取方式(超聲和回流)、不同提取時(shí)間(10、20、30min)和不同溶劑量(10、25、50、100ml)對(duì)澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶劑和溶劑量對(duì)結(jié)果有較顯著的影響，而提取方式和提取時(shí)間對(duì)含量結(jié)果影響較小，因此最終確定最佳提取條件為50ml 70%甲醇水溶液超聲提取10min。

4 結(jié)論

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)快速測(cè)定澤瀉中含量較高的三萜類成份澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B成分的含量，且重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性良好，本研究為今后藥典中建立合理的澤瀉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了良好的基礎(chǔ)。用本研究方法分析20批不同產(chǎn)地的澤瀉藥材，江西省、四川省、廣西省澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B總含量差異較大，其中四川的總含量較高，這為藥材的資源評(píng)價(jià)和合理使用提供科學(xué)參考。