張亞軍，王玉杰，張 龍，王 鵬，張建強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

前言

我國馬鈴薯種植面積已達(dá)到670×104hm2，約占世界馬鈴薯種植面積的25%，己經(jīng)成為世界馬鈴薯第一生產(chǎn)大國[1]。因此，我國馬鈴薯中營養(yǎng)物質(zhì)的提取分離及其衍生物生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但同時(shí)面臨著嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。目前，我國馬鈴薯淀粉生產(chǎn)企業(yè)己有千余家，平均每生產(chǎn)1t的淀粉就產(chǎn)生大約20t的工業(yè)廢水，其中有5t左右是含有豐富蛋白質(zhì)的有機(jī)廢水，其中僅有少數(shù)企業(yè)回收有機(jī)廢水中的蛋白質(zhì)，用于動(dòng)物飼料，大多數(shù)均直接排放，這不僅使大量的可食用性資源得不到很好的利用也對環(huán)境造成嚴(yán)重破壞[2]。

本實(shí)驗(yàn)以模擬馬鈴薯生產(chǎn)淀粉廢水為原料，以不同方法回收可食用性馬鈴薯蛋白質(zhì)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使對馬鈴薯蛋白的提取率不斷提高，促進(jìn)馬鈴薯深加工，延長馬鈴薯產(chǎn)業(yè)鏈，以減輕污水直接排放對環(huán)境造成的污染。

1 材料

1.1 材料與試劑

市售馬鈴薯。

海藻酸鈉、氫氧化鈉、氯化氫、十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等均為分析純。

1.2 儀器

組織搗碎機(jī)、漩渦混合器、磁力攪拌機(jī)、水浴恒溫振蕩器、直流穩(wěn)壓電泳儀、垂直板型電泳、脫色搖床、分析天平、離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取

市售馬鈴薯清洗干凈去皮切塊。按薯與水的質(zhì)量比(1∶2)用組織搗碎機(jī)將其磨碎成漿，靜置15min,用四層紗布過濾，濾液4℃靜置2h后,在6000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min,取上清液作為實(shí)驗(yàn)水樣(SPWE)。在打漿過程中加入1%NaHSO3防止被氧化呈褐色[3]。

2.1.1 海藻酸鈉法回收馬鈴薯蛋白質(zhì)

準(zhǔn)確量取100mL SPWE置于4個(gè)燒杯中，加入海藻酸鈉的量分別為SPWE的0.1%，0.15%，0.2%，0.25%[4]，調(diào)至一定pH，不同海藻酸鈉百分含量下設(shè)4個(gè)pH梯度(3.8、4.2、4.6、5.0),50℃下在恒溫水浴振蕩器中保持40min，在4000r/min的條件下離心15min，棄沉淀，測量并記錄上清液體積，所得上清液富含馬鈴薯蛋白。

2.1.2 酸堿沉淀法回收馬鈴薯蛋白質(zhì)

準(zhǔn)確量取100mL SPWE分別置于4個(gè)燒杯中，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH呈堿性(7.5、8.0、8.5、9.0)[5]，常溫下沉淀1h后，6000r/min離心15min，上清液分別用1mol/L HC1溶液調(diào)節(jié)pH呈酸性，每個(gè)堿梯度下設(shè)4個(gè)酸梯度，分別為(3.8、4.2、4.6、5.0)，常溫下沉淀10min，8000r/min離心15min，棄沉淀，測量并記錄上清液體積，所得上清液富含馬鈴薯蛋白。

2.2 Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度

以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。取七個(gè)試管，分別加入100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，不足1.2ml的部分用無離子水補(bǔ)足，再分別加入4ml考馬斯亮蘭G-250試劑，其中一號管為對照管。每加完一管，立即在旋渦混合器上混合，待5min后，在紫外分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸收值。以吸光值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取提取好的蛋白上清液2ml，加2ml考馬斯亮蘭G-250試劑。5min后，在分光光度計(jì)上測定樣品在595nm處的光吸收值[7]。根據(jù)A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白含量。

2.3 SDS-PAGE檢測蛋白純度

參考胡能書和萬賢國的制備分離膠、濃縮膠方法，濃縮膠T=3.75%，分離膠T=7.5%[8]。在電泳槽中加入pH=8.3的電極緩沖液，每空加樣品處理液10ul。接通電源后調(diào)節(jié)電壓為100V，電流為50mA。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)跑到分離膠處，電壓調(diào)至200V，電流不變，當(dāng)處理液帶跑至距分離膠下沿1cm處停止電泳[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫外分光光度法分析馬鈴薯蛋白含量

3.1.1 海藻酸鈉法回收馬鈴薯蛋白分析

由圖1可知，在pH=3.8的條件下，海藻酸鈉含量由0.1%增加到0.25%，蛋白質(zhì)含量先增加后減少，且以海藻酸鈉含量為0.2%時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高；在pH=4.2的條件下，隨著海藻酸鈉百分含量的增加，蛋白質(zhì)含量先增加后減少，且以海藻酸鈉含量為0.15%時(shí)蛋白含量最高；在pH=4.6的條件下，隨著海藻酸鈉百分含量增加，蛋白質(zhì)含量先減少后增加，且以海藻酸鈉含量為0.1%時(shí)蛋白含量最高；在pH=5.0的條件下，隨著海藻酸鈉百分含量增加，蛋白質(zhì)含量持續(xù)降低。

當(dāng)海藻酸鈉含量為0.1%，0.15%或0.25%時(shí)，在4個(gè)pH梯度下，pH=4.2時(shí)，蛋白質(zhì)含量均為最高；當(dāng)海藻酸鈉含量為0.20%時(shí)，在4個(gè)不同pH梯度下，pH=3.8時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高(如圖1)。

綜合以上兩個(gè)因素分析可知，當(dāng)加入的海藻酸鈉含量為0.15%-0.20%，且pH值在3.8時(shí)，或海藻酸鈉含量為0.20%，且pH值在4.2時(shí)，蛋白質(zhì)的含量均較高，即提取率較高，與其他條件下所提取蛋白的含量差異顯著(如圖1)。

圖1 加入不同百分含量海藻酸鈉，設(shè)置不同pH值對所提取蛋白含量的影響

3.1.2 酸堿沉淀法回收馬鈴薯蛋白分析

由圖2可知，當(dāng)pH=7.5時(shí)，在4個(gè)不同的酸梯度下，當(dāng)pH值由3.8增加到5.0時(shí)，蛋白質(zhì)含量先增加后減少再增加，且以pH=5.0時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=8.0時(shí)，在4個(gè)不同的酸梯度下，當(dāng)pH值由3.8增加到5.0時(shí)，蛋白質(zhì)含量先減少后增加再減少，且以pH=4.6時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=8.5時(shí)，在4個(gè)不同的酸梯度下，當(dāng)pH值由3.8增加到5.0時(shí)，蛋白質(zhì)含量先減少后增加，且以pH=5.0時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=9.0時(shí)，在4個(gè)不同的酸梯度下，當(dāng)pH值由3.8增加到5.0時(shí)，蛋白質(zhì)含量先減少后增加再減少，且以pH=4.6時(shí)蛋白質(zhì)含量最高。

固定酸度pH值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=3.8時(shí)，在4個(gè)不同堿梯度下，當(dāng)pH值由7.5增加到9.0，蛋白質(zhì)含量先增加后減少，且以pH=8.0時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=4.2時(shí)，在4個(gè)不同堿梯度下，當(dāng)pH值由7.5增加到9.0，蛋白質(zhì)含量先減少后增加再減少，且以pH=8.5時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=4.6時(shí)，在4個(gè)不同堿梯度下，當(dāng)pH值由7.5增加到9.0，蛋白質(zhì)含量先增加后減少，且以pH=8.0時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；當(dāng)pH=5.0時(shí)，在4個(gè)不同堿梯度下，當(dāng)pH值由7.5增加到9.0，蛋白質(zhì)含量先增加后減少，且pH=8.0時(shí)蛋白質(zhì)含量最高(如圖2)。

綜合以上兩個(gè)因素分析可知，堿沉淀pH值為8.0、酸提取pH值為4.6和5.0時(shí)，或堿沉淀pH值為8.5時(shí)，酸提取pH值為4.6時(shí)，蛋白含量均高，且與其他條件下所提取蛋白的含量差異顯著(如圖2)。

圖2 不同酸堿范圍的pH值對所提取蛋白含量的影響

3.2 馬鈴薯蛋白電泳圖譜分析

3.2.1 海藻酸鈉法電泳圖譜分析

圖3a和圖3b為不同海藻酸鈉百分含量下及同一海藻酸鈉百分含量的不同pH梯度下蛋白電泳圖譜。由圖3a可知，在海藻酸鈉百分含量為0.15的任一pH梯度下比海藻酸鈉百分含量為0.10的條帶都要清晰。在海藻酸鈉百分含量為0.10時(shí)，隨著pH梯度增加，條帶的清晰度降低，表明蛋白含量降低，同時(shí)蛋白條代數(shù)減少，表明蛋白種類減少；在海藻酸鈉百分含量為0.15時(shí)，隨著pH梯度增加，條帶的清晰度顯著降低，表明蛋白含量降低[10]。

由圖3b可知，在海藻酸鈉百分含量為0.20的任一pH梯度下比海藻酸鈉百分含量為0.25的條帶都要清晰。在海藻酸鈉百分含量為0.20時(shí)，隨著pH梯度增加，條帶的清晰度降低，表明蛋白含量降低；在海藻酸鈉百分含量為0.25時(shí)，隨著pH梯度增加，條帶的清晰度顯著降低，表明蛋白含量降低[11]。

綜合以上兩個(gè)因素分析可知，在海藻酸鈉百分含量為0.15，pH值為3.8和4.2時(shí)條帶較為清晰；在海藻酸鈉百分含量為0.2，pH值為3.8時(shí)條帶較為清晰；表明這三種提取條件下，蛋白提取率均最高。

a：1-12.海藻酸鈉百分含量為0.15%；13-24.海藻酸鈉百分含量為0.10% b：1-12.海藻酸鈉百分含量為0.25%；13-24.海藻酸鈉百分含量為0.20% 1-3，13-15為pH=5.0；4-6，16-18為pH=4.6；7-9，19-21為pH=4.2；10-12，22-24為pH=3.8圖3 不同百分含量海藻酸鈉下，采用不同pH值所提取蛋白電泳圖譜

3.2.2 酸堿沉淀法電泳圖譜分析

圖4a和圖4b為不同酸堿梯度下蛋白電泳圖譜。由圖4a可知，在堿梯度為8.0下的任一酸梯度下，其電泳條帶都要比堿梯度為7.5的任一酸梯度下的電泳條帶清晰，但提取到的蛋白種類較少。在堿度為7.5時(shí)，下設(shè)酸梯度增大，蛋白條帶逐漸清晰，表明蛋白含量提高；在堿梯度為8.0時(shí)，下設(shè)酸梯度增大，蛋白條帶先清晰后黯淡再清晰，且以酸梯度為4.6和5.0時(shí)條帶最為清晰，表明蛋白含量最高。

由圖4b可知，堿沉淀pH值為8.5時(shí)，條帶7-9較為黯淡，可能是因?yàn)楸４娌恢懿糠值鞍资Щ睿溆嚯娪緱l帶都要比堿梯度為9.0的任一酸梯度下的電泳條帶清晰。當(dāng)堿沉淀pH值為8.5時(shí)，隨著下設(shè)酸梯度增大，蛋白條帶顯著變清晰，表明蛋白含量增加；當(dāng)堿沉淀pH值為9.0時(shí)，隨著下設(shè)酸梯度增大，蛋白條帶由清晰到黯淡再到清晰，表明蛋白含量先減少后增加，且以pH為4.6和5.0時(shí)條帶最為清晰，蛋白含量最高。

綜合以上兩個(gè)因素分析可知，堿沉淀pH值為8.0,酸提取pH值為4.6和5.0時(shí)條帶較為清晰；堿沉淀pH值為8.5時(shí)，酸提取pH值為4.6時(shí)，蛋白條帶較為清晰，表明蛋白含量高，提取效果佳。

a：1-12.堿沉淀pH為8.0；13-24.堿沉淀pH為7.5 b：1-12.堿沉淀pH為9.0；13-24.堿沉淀pH為8.5 1-3，13-15為pH=5.0；4-6，16-18為pH=4.6；7-9，19-21為pH=4.2；10-12，22-24為pH=3.8圖4 不同酸堿范圍的pH值下所提取蛋白電泳圖譜

3.2.3海藻酸鈉法與酸堿沉淀法混合點(diǎn)樣電泳圖譜分析

為檢測不同百分含量的海藻酸鈉和采用不同pH梯度進(jìn)行酸堿沉淀得到的蛋白是否一致，本實(shí)驗(yàn)挑選了各處理下蛋白含量較高的樣品進(jìn)行了混合點(diǎn)樣。如圖5所示，所有條帶均在一條直線上，并未見明顯的條帶分層現(xiàn)象，證明海藻酸鈉法和酸堿沉淀法提取的為同種蛋白；且不同海藻酸鈉百分含量下設(shè)不同pH梯度下提取的也為同種蛋白；且不同的酸堿梯度下提取的也為同種蛋白[12]。

1-3為加入海藻酸鈉百分含量為0.15%，pH=3.8、4.2和加入海藻酸鈉百分含量為0.20%，pH=3.8三種處理混合點(diǎn)樣；4-5為堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6、5.0二種處理混合點(diǎn)樣；6-8為加入海藻酸鈉百分含量為0.15%，pH=3.8和堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二種處理混合點(diǎn)樣；9-11為加入海藻酸鈉百分含量為0.15%，pH=4.2和堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二種處理混合點(diǎn)樣；12-14為加入海藻酸鈉百分含量為0.20%，pH=3.8堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=4.6二種處理混合點(diǎn)樣；15-17為加入海藻酸鈉百分含量為0.15%，pH=3.8和堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二種處理混合點(diǎn)樣；18-20為加入海藻酸鈉百分含量為0.15%，pH=4.2和堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二種處理混合點(diǎn)樣；21-23為加入海藻酸鈉百分含量為0.20%，pH=3.8堿沉淀pH=8.0，酸提取pH=5.0二種處理混合點(diǎn)樣。圖5 不同百分含量的海藻酸鈉和不同pH梯度酸堿沉淀酸所提取蛋白混合電泳圖譜

4 討論

本研究表明，海藻酸鈉法回收馬鈴薯蛋白的效果優(yōu)于酸堿沉淀法。且在海藻酸鈉百分含量為0.15-0.20時(shí)，pH值在3.8-4.2時(shí)，提取效果最佳，這與熊淑芳等對馬鈴薯提取淀粉后廢水中蛋白質(zhì)的回收利用研究結(jié)果相同[13]，也與潘牧等對馬鈴薯蛋白的研究進(jìn)展研究結(jié)果相同[14]。酸堿沉淀法提取馬鈴薯中蛋白，堿沉淀pH值應(yīng)在8.0-8.5之間，酸提取pH值應(yīng)在4.6-5.0之間，回收效果最佳，這與任瓊瓊等對馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)的提取研究結(jié)果并不相同[15]，該研究表明堿度pH值在9.0左右，酸度pH值在4.0左右提取效果最佳，這可能與其它相關(guān)處理不同有關(guān)，如沉淀時(shí)間、離心時(shí)間等[16]。本研究將有助于回收馬鈴薯提取淀粉后廢水中蛋白質(zhì)的回收利用，減少對資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。